Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Метод гибридизации in situ* (на месте, лат.) основан на способности ДНК или РНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК / РНК - зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.

Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам. В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также мазков клеток буккального эпителия и крови.

Метод гибридизации in situ имеет особое значение для практической цитогенетики, благодаря разработке неизотопного варианта, основанного на использовании зондов, меченных нерадиоактивными модифицированными нуклеотидами. Неизотопные варианты гибридизации на препаратах (в особенности флюоресцентные) имеют ряд преимуществ по сравнению с изотопными: большую разрешающую способность, которая равна разрешающей способности микроскопа (0,1 - 0,2 мкм), отсутствие необходимости в статистической обработке результатов, быстроту и безопасность для здоровья исследователей

Кроме того, комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одной клетке или на одной метафазной пластинке. А использование в качестве ДНК-зондов повторяющихся последовательностей, меченых флюорохромами, сокращает время проведения процедуры до 7 - 9 часов (классический неизотопный вариант гибридизации занимает два дня, изотопные варианты от недели до месяца), что особенно важно для пренатальной диагностики. Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах.

Принцип FISH-метода

В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического или цитологического препарата.
Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2. Предварительная обработка (если необходимо).
Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация.
Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.

4. Гибридизация.
После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5. Промывка.
После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6. Контр-окрашивание.
При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа. Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

* - Материал подготовлен на основе информации открытых источников.

Флюоресцентная гибридизация in situ

Флюоресце́нтная гибридиза́ция in situ , или метод FISH (англ. Fluorescence in situ hybridization - FISH ) - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ . Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани . В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Зонды

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды , меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин - при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3-4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР -реакции, меченые олигонуклеотиды , а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции .

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флюоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида , что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов - эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Литература

• Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий. Глава в книге «Введение в молекулярную диагностику» Т. 2. «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний» / Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. Учебная литература для студентов медицинских вузов. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Флюоресцентная гибридизация in situ" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. гибридизация. Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности… … Википедия

Транскрипт

1 Цитогенетические методы: кариотипирование, FISH Михаил Кибанов, к.б.н. Лекция прочитана в рамках проекта genschool.ru, октябрь 2016 г.

2 Цитогенетика: где мы?

3 Цитогенетика Изучение генетической конституции клеток человека с помощью визуализации и анализа хромосом Совокупность методов анализа Выявление типа хромосомной аномалии Установление взаимосвязи между аномальным фенотипом пробанда и хромосомной патологией

4 Методы Кариотипирование Interphase-FISH Metaphase FISH Multi-color FISH MCB-FISH CGH Array-CGH

5 «Рождение» медицинской цитогенетики 1956 г: нормальный хромосомный набор человека 46 хромосом The chromosome number in man. JOE HIN TJIO and ALBERT LEVAN. Hereditas, vol. 42, pp г: хромосомный набор пациентов с синдромом Дауна 47 хромосом . LEJEUNE J, GAUTIER M, TURPIN R. C R Hebd Seances Acad Sci. 248(11): French

6 «Золотой век» цитогенетики Генетическая природа синдрома Клайнфельтера A case of human intersexuality having a possible XXY sex-determining mechanism. JACOBS PA, STRONG JA. Nature Jan 31; 183(4657): Генетическая природа синдрома Шерешевского-Тернера A sex-chromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis (Turner"s syndrome). FORD CE, JONES KW, POLANI PE, DE ALMEIDA JC, BRIGGS JH. Lancet Apr 4;1(7075): Генетическая природа синдрома Патау (+13) Multiple congenital anomaly caused by an extra autosome. PATAU K, SMITH DW, THERMAN E, INHORN SL, WAGNER HP. Lancet Apr 9;1(7128): Генетическая природа синдрома Эдвардса (+18) A new trisomic syndrome. EDWARDS JH, HARNDEN DG, CAMERON AH, CROSSE VM, WOLFF OH. Lancet Apr 9;1(7128):

7 Хромосомные аномалии Числовые (геномные мут ации) Структурные (хромосомные мут ации) Полиплоидия триплоидия (3n=69) тетраплоидия (4n=92) Реципрокные транслокации (rcp) Робертсоновские транслокации (rob) Инсерции (ins) Анеуплоидия трисомия (2n+1=47) моносомия (2n-1=45) нуллисомия (2n-2=44) полисомия (47,ХХХХ) Делеции (del) Дупликации (dup) Инверсии (inv) Изохромосомы (i) Кольцевые хромосомы (r) Маркерные хромосомы (mar)

8 Кариотипирование Колхицин Кольцемид Фиксатор Карнуа ¼ Уксусная кислота ¾ метанол 2-3 последовательные фиксации Культивирование клеток Блок на стадии метафазы митоза Гипотоническая обработка Фиксация Приготовление препаратов хромосом Лимфоциты Клетки ворсин хориона Амниоциты Фибробласты М KCl «-» Наложение хромосом «+» Потеря хромосом Влажность!!! GTG RHG CBG NOR Дифференциальное окрашивание хромосом

9 Кариограмма Препарат метафазных хромосом при х100 G-окрашивание Метафазная пластинка при х1000 Кариотип: 46,ХХ 46,ХY Согласно ISCN!

10 Варианты дифференциального окрашивания

11 G-окрашивание (GTG: G-banding Trypsin Giemsa) Наиболее распространенный метод дифференциального окрашивания Легко воспроизводимый Четкий рисунок Не происходит повреждения ДНК FISH «-» слабое окрашивание концевых участков хромосом Нарушение морфологии хромосом

12 R-окрашивание (RHG: R-bands Heating Giemsa) Альтернативный GTG-методу способ дифференциальной окраски: Рисунок окраски противоположен G- рисунку Лучшее окрашивание теломер Лучшее сохранение морфологии хромосом «-» Более «капризный» метод (t, ph) менее воспроизводимый Повреждение ДНК

13 C-окрашивание (CBG: C-bands Barium hydroxide Giemsa) Метод избирательного окрашивания прицентромерного гетерохроматина: Центромерные районы всех хромосом Полиморфные гетерохроматиновые блоки (1,9,16,Y)

14 NOR-окрашивание (Nucleolar organizers) Метод избирательного окрашивания активных ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21, 22)

15 Окрашивание с помощью Hoechst 33258, контрастирование Актиномицином D Скрининговый метод окрашивания Морфология хромосом соответствует G-окрашиванию

16 Молекулярная природа G- и R-сегментов G-сегменты: АТ-богатые Гены, определяющие тканеспецифичную дифференцировку Репликация в позднюю S-фазу LINE+ R-сегменты GC-богатые Гены «домашнего хозяйства» Репликация в ранней S-фазе SINE+,Alu+

17 Разрешение Условия приготовления препаратов хромосом Морфология хромосом Разрешение Количество сегментов Среднее разрешение, Mb >

18 Кариотипирование: «+» и «-» «-» Культура живых клеток с высокой митотической активностью Преимущественная пролиферация клеток с нормальным кариотипом (или наоборот) Невозможность анализа при отсутствии делящихся клеток «-» Относительно невысокая разрешающая способность - 10 Мв Невозможность определения микрохромосомных перестроек (делеций, дупликаций, инверсий, инсерций) «-» Качество анализа зависит от опыта исследователя и качества препаратов (морфологии хромосом, окрашивания) Невозможность определения хромосомной принадлежности генетического материала при отсутствии четкого рисунка «+» анализ структуры и количества непосредственно хромосом Выявление сбалансированных транслокаций, маркерных хромосом, мозаицизма

19 Хромосомные перестройки у супружеских пар с бесплодием Наличие сбалансированной хромосомной транслокаций у одного из партнеров приводит к систематическим невынашиваниям и ранним абортам; является причиной сниженной мужской фертильности Реципрокные транслокации 46,ХY,t(18;22)(q21.1;q12) Робертсоновские транслокации 45,XY,rob(13;14)(q10;q10) Х Y

20 Варианты сегригации хромосом у носителей Робертсоновских и реципрокных транслокаций в МI 2 варианта Оба - норма 16 возможных вариантов Один норма Один сбалансированный 6 возможных вариантов Один норма Один - сбалансированный

21 Комплексные хромосомные аномалии (complex chromosomal rearrangements - CCRs)

22 ISCN An International System for Human Cytogenetic Nomenclature 1960, Денвер: первые шаги по классификации хромосом человека (по размеру, центромерному индексу) 1963, Лондон: хромосомы разбиты на группы от A до G 1966, Чикаго: короткое плечо «p» (petit) длинное плечо «q» (m, n, o, p, q, r, s) 1971, Париж: заложены основные принципы ISCN 1977, Стокгольм: обобщение и сведение результатов всех предыдущих встреч 1978, первая ISCN 1980, Париж. 1994, Мемфис. 2004, 2008, Ванкувер Сиэтл

23 Номенклатура морфологии хромосом после дифференциального окрашивания

24 Основные принципы обозначения аномального кариотипа 50,X,+X,-Y,+10,+14,+17,+21 46,t(X;18)(p11.1;q11.2),t(Y;1)(q11.2;p13) 47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22),r(10)(p12q25),+21 49,X,inv(X)(p21q26),+3,inv3(q21q26.2),+7,+10,-20,del(20)(q11.2),+21 50,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p34q41),+8,-21 52,XY,.,+r,+mar

25 Гибридизация in situ «рождение» молекулярной цитогенетики: 1980-е Мечение с помощью радиоизотопов Мечение с помощью флуоресцентных красителей Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

26 FISH: «+» и «-» «±» Таргетный анализ: зависит от специфичности используемого ДНК-зонда «+» Разрешающая способность Kв Возможность определения микрохромосомных перестроек (делеций, дупликаций, инверсий, инсерций) «+» Более объективный метод анализа «+» Относительно легкий, быстрый и хорошо воспроизводимый метод «+» Возможность проведения анализа на культурах клеток с низкой митотической активностью, фиксированных клетках и тканях (interphase FISH)

27 Области применения FISH Преимплантационная генетическая диагностика Преимплантационный генетический скрининг (определение анеуплоидий хромосом 13,15,16,17, 18,21,22,X,Y) Преимплантационная генетическая диагностика (исследование дериватных хромосом у носителей хромосомных перестроек) Пренатальная диагностика Скрининг основных анеуплоидий некультивированных клеток амниотической жидкости Уточнение/верификац ия результатов стандартного цитогенетического исследования Постнатальная диагностика Уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследования Исследование сложных перестроек тройных и более сложных транслокаций, инсерций Определение степени мозаицизма Исследование природы маркерных хромосом Исследование хромосомных перестроек в онкогематологии Диагностика солидных опухолей Скрининг анеуплоидий сперматозоидов

28 ДНК-пробы LSI локус-специфичные пробы (locus specific identifiers) CEP центромероспецифичные пробы (chromosome enumeration probes) WCP- цельнохромосомные пробы (whole chromosome painting probes) SubTel субтеломерные пробы (хромосомоспецифичные) (subtelomere probes) Telp/Telq теломероспецифичные пробы (telomere probes)

29 Варианты FISH Metaphase FISH Interphase FISH Multi-color FISH MCB-FISH

30 LSI локус-специфичные пробы (locus specific identifiers) - Специфичны к строго определенным последовательностям ДНК Используются в диагностике: Анеуплоидий Делеций Дуликаций Инверсий Транслокаций Уточнение точек разрыва при хромосомных перестройках Микроделеционных синдромов nuc ish Xcen(DXZ1x1),Ycen(DYZ3x1),13q14(RB1x2), 18cen(D18Z1x1),21q22(D21S341x2) PGT multicolor probe mix (Abbott molecular): X blue, Y gold, 13 red, 18 aqua, 21 green.

31 Микроделеционные синдромы, выявляемые с помощью FISH Cri-du-Chat Miller-Dieker Syndrome Smith-Magenis Syndrome DiGeorge/Velo-Cardio- Facial/CATCH-22/Shprintzen Syndrome Kallman Syndrome Williams Syndrome Wolf-Hirschhorn Prader-Willi/Angelman Syndrome Анализ методом FISH с использованием пробы, специфичной к 22q11.2 (DiGeorge Syndrome critical region) - сигнал красного цвета. Сигнал зеленого цвета внутренний контроль.

32 CEP центромероспецифичные пробы (chromosome enumeration probes) - Специфичны к центромерным и прицентромерным повторам ДНК Используются в диагностике: Быстрый скрининг анеуплоидий Транслокаций Определение природы цетромеры маркерных хромосом 47, XXY Скрининг анеуплоидий хромосом сперматозоидов

33 WCP- цельнохромосомные пробы (whole chromosome painting probes) Специфичны в отношении всей хромосомы - окрашивание p- и q-плечей Используются в диагностике: Исследование хромосомных перестроек - транслокаций, инсерций Верификация, уточнение результатов кариотипирования Определение природы маркерных хромосом, дополнительного хромосомного материала

34 Multi-color FISH (спектральное кариотипирование - SKY) Одновременный анализ всех 24 хромосом Используются в диагностике: Изучение сложных межхромосомных перестроек тройных и более сложных транслокаций, инсерций Определние природы маркерных хромосом 2 n - 1

35 Multicolor banding MCB FISH Изучение внутрихромосомных перестроек: Инверсий Инсерций Делеций Дупликаций Уточнение точек разрывов при межхромосомных перестройках

36 MCB-FISH для уточнения точек разрыва при комплексной хромосомной перестройке (CCR) 46,XX,der(4),der(5),der(6)

37 G-banding Стандартный (сег.) Высокого разрешения (1000 сег.) FISH Аналит. разрешение Числ.хр. нарушения Структурные перестройки сбл несбл CNV LOH Мозаицизм 5-10 Mb > 6% 1-2 Mb > 6% LSI-пробы до 100 kb % Array-CGH Human CGH 44K Human CGH 180K Human CGH +SNP, 180K Human CGH +SNP, 400K kb > 20% kb > 20% kb > 20% kb > 20%

38 Приказ Минздрава РФ от N 316 (ред. от) "О дальнейшем развитии медико-генетической службы Министерства здравоохранения Российской Федерации" Основным видом деятельности учреждений МГС является профилактика врожденной и наследственной патологии путем организации и проведения ретрои проспективного медико-генетического консультирования, пренатальной диагностики, преклинической диагностики у новорожденных наследственных болезней, направление больных на лечение и диспансерное наблюдение семей с наследственной патологией. Уровни организации МГС (Приложение 1, п.2): районный, городской региональный (областной, краевой, республиканский) межрегиональный Федеральный (МГЦ) Задачи подразделений МГК (Приложение 2) Регламентация работы персонала МГК (Приложение 2) Пример штатного расписания МГК (Приложение 2) Перечень основного оборудования и реактивов (Приложение 3) Нормативы расхода спиртов (Приложение 3)

39 Приказ от 15 ноября 2012 г. N 917н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи больным с врожденными и (или) наследственными заболеваниями» Правила организации деятельности медико-генетической консультации (центра) (Приложение 1) Рекомендуемые штатные нормативы (Приложение 2) Стандарт оснащения цитогенетической лаборатории (с возможностью проведения FISH) (Приложение 3) Стандарт оснащения лаборатории молекулярно-генетической диагностики (Приложение 3) Приказ Минздрава России от N 457 "О совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей" Инструкция по проведению инвазивной диагностики плода и генетического исследования биоптатов клеток (Приложение 3)

40 Литература R.J. McKinlay Gardner, Grant R. Sutherland and Lisa G. Shaffer (2012).Chromosome abnormalities and genetic counseling.4th ed. Oxford University Press, New York. С. Г. Ворсанова, Ю. Б. Юров В. Н. Чернышов Медицинская цитогенетика Медпрактика-М, 2006 Баранов В.С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научнопрактические аспекты. СПб: Издательство Н-Л, с

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ «Кариотип» это совокупность морфологических особенностей полного хромосомного набора единичной клетки. Кариотипирование - анализ числа и структуры метафазных хромосом из клеток

Кариотипирование супружеской пары важный диагностический шаг при проблемах в репродуктивной сфере А.А. Бровко, клиника «Исида» Одним из основных тестов, предназначенных для супружеских пар при проблемах

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ХРОМОСОМНОГО АНАЛИЗА (КАРИОТИПИРОВАНИЯ) Хромосомный набор человека Как известно, хромосомы находятся в ядре клетки и состоят из нуклеиновых кислот и белков. Один из типов нуклеиновых

Занятие 6. Изменчивость и ее значение в онтогенезе человека. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Генный, хромосомный и геномный уровни нарушения генетического аппарата. Генные болезни как результат

Основные показания для ПГД - Пары, у которых в анамнезе были случаи рождения детей с наследственной и врожденной патологией; - пары, в кариотипе которых имеются сбалансированные хромосомные аберрации;

Молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний Филатова Людмила Менеджер по продукции К.б.н Сравнительные характеристики методик Метод Морфология FISH Проточная цитофлуориметри я ОТ-ПЦР (транслокации)

Ò. Â. Îñàä óê, Ê. À. Ìîññý ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÂÛÑÎÊÎÈÍÔÎÐÌÀÒÈÂÍÛÕ ÄÍÊ-ÌÀÐÊÅÐÎÂ ÄËß ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÈ ÈÑËÎÂÛÕ ÀÍÎÌÀËÈÉ ÕÐÎÌÎÑÎÌ ÅËÎÂÅÊÀ ÃÓ «Ðåñïóáëèêàíñêèé íàó íî-ïðàêòè åñêèé öåíòð «Ìàòü è äèòÿ»» èñëîâûå àíîìàëèè

ХРОМОСОМНЫ Е БОЛЕЗНИ Хромосомные болезни группа врождённых наследственных заболеваний, характеризующихся множественными врождёнными пороками развития. В основе лежат хромосомные или геномные мутации. История

ПГС (ПГТ-А) эмбрионов 5 дня развития методом NGS: открывшиеся возможности и сложности М.А. Стрижова, Р.В. Васильев, С.В. Вяткина, М.Н. Павлова, Н.В. Андреева, К.О. Годунов, М.В. Кречмар, Д.А. Лобзева,

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Р.А. Часнойть 12 февраля 2010 г. Регистрационный 118-1109 МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА: ОСОБЕННОСТИ ПОСТНАТАЛЬНОГО КАРИОТИПИРОВАНИЯ ВВЕДЕНИЕ В настоящее время не вызывает сомнений постулат, что ни одна врачебная специальность не может обойтись без знаний основ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НИУ «БелГУ») МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 001.016.01 НА БАЗЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО НАУЧНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА

1.Пояснительная записка Рабочая программа предметного курса по биологии разработана на основе программы Фроловой Г. Н., Ходиковой Т. Ф. (сборник. Биология. 10-11 классы. Профильное обучение. Программы

1 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 001.016.01 НА БАЗЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ПО ДИССЕРТАЦИИ НА

ГБОУ СПО «КИСЛОВОДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ» МИНЗДРАВА РОССИИ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ 0П.04 Генетика человека с основами медицинской генетики по специальности: 34.0.01 Сестринское дело Кисловодск,

Координация различных методов генетического анализа в клинической практике Д.б.н. Стрельников Владимир Викторович Зав. лаб. эпигенетики ФГБНУ "МГНЦ" Проф., кафедра молекулярной и клеточной генетики РНИМУ

P A R T N E R " S P R E S E N T A T I O N МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД Вороная Ю.М 1мед 1группа S E C T I O N F O U R МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Большая и разнообразная группа методов, предназначенная

Маленькая жёлтая книжка Справочник по редким хромосомным отклонениям Составители: доктор Беверли Сёрл (бакалавр наук (BSc, HONS) по специальности «Биология», PhD, член Королевского биологического общества

1. Фонд оценочных средств для проведения промежуточной аттестации обучающихся по дисциплине (модулю): Общие сведения 1. Кафедра СПиСП 2. Направление подготовки 44.03.03 Специальное (дефектологическое)образование

1 Рабочая программа учебной дисциплины разработана на основе Федерального государственного образовательного стандарта (далее ФГОС) по специальности (специальностям) среднего профессионального образования

На правах рукописи Миньженкова Марина Евгеньевна МЕТАФАЗНАЯ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ХРОМОСОМНОГО ДИСБАЛАНСА 03.02.07 «генетика» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ: СПЕКТР И ЧАСТОТА ВЫЯВЛЯЕМОЙ ПАТОЛОГИИ Е.В. Мусатова, Я.В. Софронова, Р.А. Биканов, В.С. Каймонов, Е.А. Померанцева Санкт-Петербург, 2017

Пренатальная диагностика врожденных нарушений развития ребенка Гл.специалист МЗ РТ по медицинской генетике Вафина З.И. Генетический груз врожденной и наследственной патологии Всего 40-70 на 1000 живорожденных

ИНФОРМИРОВАННОЕ СОГЛАСИЕ НА ОКАЗАНИЕ УСЛУГ ПО ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЭМБРИОНОВ (ПГД) Настоящее добровольное согласие составлено в соответствии Федеральным законом РФ об основах охраны

Генетика Прогноз эволюции болезни Пренатальная диагностика Новые методы диагностики Понимание патогенеза Зачем нужны врачу генетические знания? Предсимптоматическая диагностика Планирование семьи Клеточная

2 СОДЕРЖАНИЕ Стр. 1. ПАСПОРТ ПРОГРАММЫ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ 4 2. СТРУКТУРА И СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ 3. УСЛОВИЯ РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ 4. КОНТРОЛЬ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОСВОЕНИЯ УЧЕБНОЙ

Медицинский колледж ФГБОУ ВО ДГМУ Минздрава России РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ 0П.04 Генетика человека с основами медицинской генетики Специальность 31.0.0 Акушерское дело Махачкала, 017 г. 1

Опыт централизации лабораторных исследований при онкогематологической патологии на базе бюджетного учреждения здравоохранения Омской области «Клинический диагностический центр». Комплексный подход к диагностике

2 Разработчик программы: В.В.Радыгина, доцент кафедры педагогики и психологии непрерывного образования факультета переподготовки специалистов образования ИПКиП БГПУ, кандидат биологических наук, доцент.

1 Рабочая программа учебной дисциплины разработана на основе Федерального государственного образовательного стандарта среднего профессионального образования по специальности 34.02.01 Сестринское дело Организация

ДЕПАРТАМЕНТ СМОЛЕНСКОЙ ОБЛАСТИ ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ ПРИКАЗ О порядке мероприятий по пренатальной (дородовой) диагностике нарушений развития ребенка в Смоленской области В целях повышения эффективности дородовой

Комитет по здравоохранению Санкт-Петербурга Санкт-Петербургское государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение «Медицинский колледж 1» УТВЕРЖДАЮ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» Институт физики, нанотехнологий и телекоммуникаций

КАРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА ПРИМЕРЕ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ХИРОНОМИД Сценарий учебного видеофильма из видеокомплекса «Видеопрактика по цитологии в НГУ» В. В. Голыгина, О. В. Ермолаева, А. Д. Брошков Аннотация.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Д.Л. Пиневич 16.03.2011 Регистрационный 124-1110 МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ ПРИ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКАХ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ

Современные подходы к генетической диагностике наследственных заболеваний в акушерстве и гинекологии. Константин Шевченко ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека» «редкие болезни редки до тех пор, пока

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КАЛУЖСКОЙ ОБЛАСТИ ПРИКАЗ * ^ Об организации работы консультативно - диагностического отделения, кабинета катамнеза и медико - генетической консультации перинатального центра

Методы идентификации хромосом. Хромосомные перестройки. Лекция 3. Монохромное окрашивание хромосом. Дифференциальное окрашивание хромосом. Возможности идентификации хромосом на протяжении клеточного цикла

Окружной кабинет пренатальной диагностики нарушений внутриутробного развития ребенка 1. Зачем Вас посылают в окружной кабинет? Данный кабинет осуществляет диагностику в 11-13 нед.+ 6 дней беременности

Genetico.ru 8 800 250 90 75 (звонок по России бесплатный) ПРЕИМПЛАНТАЦИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА Москва, ул. Губкина, д. 3, корп. 1 Лицензия ЛО-77-01-013305 обследование эмбриона на наследственные

Кариотип человека Методы изучения кариотипа Получение хромосомных препаратов: - выделение митотических клеток - лизис клеток в гипотонических условиях и разбрызгивание хромосом - окраска препаратов Флюоресцентная

Приложение к приказу СПб ГКУЗ МГЦ от 0626 5/Ц УТВЕРЖДЕН приказом от 0626 г. 5/Ц Комитет по здравоохранению Санкт-Петербурга Санкт-Петербургское государственное казенное учреждение здравоохранения "Диагностический

Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) основанное на Одно- Нуклеотидных Полиморфизмах (ОНП) Внеклеточная ДНК (cfdna) внк ДНК происходит из апоптотических клеток, получаемых из: Крови матери Адипоциты

По итогам обсуждения принято следующее заключение: диссертационная работа Черных В.Б. «Аномалии половых хромосом при нарушениях формирования пола и репродукции человека» посвящена актуальной проблеме исследованию

Неинвазивная пренатальная молекулярно-генетическая диагностика плода на трисомии 13, 18 и 21 хромосом методом секвенирования нового поколения (NGS) и расчет Z- распределения по ДНК, выделенной из материнской

Игорь Иванович Гузов, к. м. н Генеральный директор Клиники и лаборатории ЦИР Роль комплексного пренатального скрининга в выявлении групп риска развития патологии плода Санкт-Петербург 14 марта 2008 http://www.cironline.ru

РАССМОТРЕНО На заседании цикловой комиссии общепрофессиональных дисциплин Протокол от Председатель Т.Н. Иванова (подпись) (И.О.Фамилия) УТВЕРЖДАЮ Директор КГБОУ СПО В.М. Савельев (подпись) (дата) Комплект

На правах рукописи ШИЛОВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПОДХОДОВ К ДИАГНОСТИКЕ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ В РАМКАХ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ 03.02.07 генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание

Антенатальная гибель плода: полногеномный CNV- анализ ДНК из срезов архивных тканей плаценты и пупочной вены и клинико-морфологические корреляции Stillbirth: Genome-wide copy number variation profiling

Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» (ФГБОУ ВО ИГМУ

Значение цитогенетических исследований для оценки радиационной опасности космических полетов Снигирева Г.П. 1, Новицкая Н.Н. 1, Федоренко Б.С. 2 1 ФГУ «Российский Научный Центр Рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития,

Планирование семьи с учётом генетических аномалий Сердюк А.А. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА По биологии для 10 класса среднего общего образования Элективный курс Тема: «Генетика человека» учителя биологии Сафроновой Екатерины Владимировны Екатеринбург 2016 г. Пояснительная записка.

1. ПАСПОРТ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ Генетика человека с основами медицинской генетики 1.1. Область применения программы Рабочая программа учебной дисциплины является частью основной профессиональной

Искусственные хромосомы: проблемы и перспективы С.А.Демаков Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Отдел молекулярной и клеточной биологии Новосибирск -2010 Организация хромосомы

Новые молекулярно-генетические технологии в лабораторной практике. Дьявол прячется в деталях. Филатова Людмила К.б.н. Владивосток, РАМЛД, 2015 Процедура Идеальная процедура анализа в анализа в молекулярной

СОДЕРЖАНИЕ стр. 1 ПАСПОРТ ФОНДА ОЦЕНОЧНЫХ СРЕДСТВ 4 2 ОЦЕНКА ОСВОЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ 6 2.1 ПРИМЕРНЫЕ ЗАДАНИЯ ИЛИ ИНЫЕ МАТЕРИАЛЫ 9 НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ТЕКУЩЕГО КОНТРОЛЯ УСПЕВАЕМОСТИ ПО ДИСЦИПЛИНЕ 2.2 ПРИМЕРНЫЕ

Тема 4. 7. Спермато- и оогенез. Хромосомная теория наследственности. Хромосомные перестройки в мейозе. Мейоз у полиплоидов. Сперматогенез Сперматогонии Митозы Стадия размножения Стадия роста Сперматоциты

УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой молекулярной биологии и генетики, д.м.н. Топорков А.В. протокол 1 от «28» августа 2015 г. Календарно - тематический план лекций по дисциплине «Методы и объекты генетического анализа»

Мы беседуем с главным специалистом по медицинской генетике комитета по здравоохранению Санкт-Петербурга, членом-корреспондентом РАМН, профессором Владиславом Сергеевичем Барановым. Пройти генетический

1 ПРОЕКТ Профессиональный стандарт 1. Общие положения 1. Профессиональный стандарт предназначен для: абитуриентов, осуществляющих выбор своей профессиональной деятельности; работников системы здравоохранения

Современная генетика и новые репродуктивные технологии. Modern genetics and new reproductive technologies. Преподаватели: Ким Александр Иннокентьевич (д.б.н., профессор, кафедры генетики) координатор и

FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) является незаменимым методом в диагностике онкологических заболеваний. С помощью специфических флуоресцентных зондов этот метод позволяет идентифицировать наличие геномных перестроек, то есть уточнить диагноз, уточнить прогноз и подобрать адекватную терапию - в зависимости от конкретного случая. Прежде всего, этот подход используется при онкогематологических заболеваниях. Ранее для этих целей использовали обычное кариотипирование, но, если клетки больного не дают выраженного роста в культуре, это серьёзно осложняет диагностику данным методом. В этих случаях применение FISH существенно расширяет возможности лабораторной диагностики. Кроме того, сложные хромосомные перестройки проще интерпретировать при использовании FISH.

В лаборатории используются зонды к центромерам, специфическим участкам хромосом, генов. Двухцветные зонды подбираются для поиска транслокаций таким образом, что если фрагменты двух генов, которые в норме находятся в разных участках генома, оказываются рядом, два сигнала различного цвета - по одному от каждого зонда, сливаются в один, отличающийся по свету от исходных. Так, например, выявляют распространённые среди лейкозов различных типов транслокации BCR-ABL. Такие гены, как MLL, TEL и RARα могут перестраиваться, образуя химерные гены с различными последовательностями. В этом случае два зонда подбираются к разным краям гена. Если ген цел, на препарате в каждом ядре будет одна точка, при разрыве - две точки разного цвета. За счёт этого FISH является более гибкой методикой для выявления хромосомных транслокаций, чем ПЦР. Зонд сядет на хромосому вне зависимости от того, как именно произошёл разрыв и присоединение фрагмента другой хромосомы в рамках какого-либо специфического участка, в отличие от олигонуклеотидов, применяемых в ПЦР, распознающих конкретные, хотя и распространённые перестройки.

Панель маркеров, выявляемых FISH позволяет оценить прогноз при хроническом лимфоидном лейкозе. Делеции 11q и 17p ассоциированы с неблагоприятным прогнозом, в делеция 13q, как и нормальный кариотип - с благоприятным. При трисомии по хромосоме 12 случай можно отнести к промежуточной группе риска.

Категория риска при миеломе связана также с сочетанием делеций и транслокаций, транслокации t(4;14), t(14;16) и делеция 17p связаны с неблагоприятным прогнозом. Такие диагностические исследования проводятся на биоптатах красного костного мозга после обогащения. Небольшая инверсия, сопровождающаяся формированием химерного гена EML4-ALK, характерна для немелкоклеточного рака лёгкого. Продукт химерного гена - мишень таргетной терапии. Такую перестройку тоже можно выявлять методом FISH. Амплификацию HER2 зачастую оценивают по косвенному признаку - возрастанию уровня экспрессии, используя для этого метод иммуногистохимии, однако в ряде стран рекомендуется использовать для этих целей FISH, или, по крайней мере, использовать этот метод для подтверждения.

В некоторых случаях цитогенетического исследования бывает недостаточно для выдачи заключения о кариотипе, в этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (англ. - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) .

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, базирующихся преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики. Метод in situ гибридизации был разработан для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Произошел переход в идентификации хромосом и хромосомных районов с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной. Классические методы цитогенетического анализа позволяют выявлять лишь около 15 % хромосомных перестроек, идентифицируемых с помощью SKY.

В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

• * локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;
• * альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;
• * зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно «раскрасить» всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (> 500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.