Типы метафазных хромосом, их строение. Различают четыре типа строения хромосом:телоцентрические (палочковидные хромосомы с центромерой, расположенной на проксимальном конце); акроцентрические (палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом);

субметацентрические (с плечами неравной длины, напоминающие по форме букву L); метацентрические (V-образные хромосомы, обладающие плечами равной длины). Тип хромосом является постоянным для каждой гомологичной хромосомы и может быть постоянным у всех представителей одного вида или рода

Хромосомы синтетически неактивны. Строение хромосом лучше всего изучать

в момент их наибольшей конденсации, т.е. в метафазе и начале анафазы митоза.

Каждая хромосома в метафазе митоза состоит из двух хроматид,

образовавшихся в результате редупликации, и соединенных центромерой

(первичной перетяжкой). В центральной части центромеры находятся кинетохоры, к которым во время митоза прикрепляются микротрубочки нитей веретена. В анафазе хроматиды отделены друг от друга. Из них образуются дочерние хромосомы, содержащие одинаковую генетическую информацию. Центромера делит хромосому на два плеча. Хромосомы с равными плечами называют равноплечими или метацентрическими, с плечами неодинаковой длины - неравноплечими - субметацентрическими, с одним коротким и вторым почти незаметным - палочковидными или акроцентрическими (рис. 48).

Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, отделяющую спутник.

Вторичные перетяжки называют ядрышковыми организаторами. В них в интерфазе

происходит образование ядрышка. В ядрышковых организаторах находится ДНК,отвечающая за синтез р-РНК. Плечи хромосом оканчиваются участками,

называемыми теломерами, не способными соединяться с другими хромосомами.

Число, размер и форма хромосом в наборе у разных видов могут варьировать.

Совокупность признаков хромосомного набора называют кариотипом

Хромосомный набор специфичен и постоянен для особей каждого вида. У

человека 46 хромосом, у мыши - 40 хромосом и т.д.В соматических клетках, имеющих диплоидный набор хромосом, хромосомы парные. Их называют гомологичными. Одна хромосома в паре происходит от материнского организма, другая - от отцовского. Изменения в структуре хромосом или в их числе возникают в результате мутаций. Каждая пара хромосом в наборе индивидуальна. Хромосомы из разных пар называют негомологичными.

глотку.В цитоплазме есть многочисленные пищеварительные вакуоли, на заднем конце тела находится порошица. Есть две сократительные вакуоли. К крупному макронуклеусу вплотную прилегает микронуклеус. Инфузории способны инцистироваться. Сами инфузории и их цисты могут длительное время сохранять жизнеспособность вне организма хозяина. В водопроводной воде инфузории выживают до 7 суток. Цисты остаются живыми во влажной среде (при комнатной температуре) до двух месяцев. Балантидий локализуется в толстом (иногда в тонком) кишечнике у человека, вызывая изъязвления его стенок. Клинически это тяжелое заболевание выражается в кровавом поносе, коликах, лихорадке и мышечной слабости. Основным источником распространения балантидиаза служат свиньи, зараженные балантидиями. Балантидий в кишечнике свиней образуют цисты, которые с фекалиями попадают во внешнюю среду и там сохраняются длительное время. Заражение человека происходит при занесении цист в пищеварительный тракт с грязными руками или пищей.

Часто балантидиазом болеют люди, связанные с работой по уходу за

свиньями или с обработкой свинины. Диагноз ставят при нахождении балантидиев в фекалиях.

Билет 11 Реализация генетической информации в клетке. Регуляция активности генов про- и эукариот. 2. Онтогенез, его периодизация. Морфо-функциональные и генетические особенности половых клеток.

Реализа́ция генети́ческой информа́ции - процесс, происходящий внутри каждой живой клетки , во время которого генетическая информация , записанная в ДНК , воплощается в биологически активных веществах - РНК и белках . Переход генетической инфо рмации от ДНК к РНК и от РНК к белку является универс альным для всех без исключения клеточных организмов. Представление об этом информационном потоке называетсяцентральной догмой молекулярной биологии.Принципиальная схема реализации генетической информации у про- и эукариот.
ПРОКАРИОТЫ. У прокариот синтез белка рибосомой (трансляция ) пространственно не отделен от транскрипции и может происходить еще до завершения синтеза мРНК РНК-полимеразой . Прокариотические мРНК часто поли цистронные , то есть содержат несколько независимых генов .
ЭУКАРИОТЫ. мРНК эукариот синтезируется в виде предшественника, пре-мРНК, претерпевающего затем сложное стадийное созревание - процессинг , включающий присоединение кэп -структуры к 5" -концу молекулы, присоединение нескольких десятков остатков аденина к ее 3" -концу (полиаденилирование ), выщепление незначащих участков - интронов и соединение друг с другом значащих участков - экзонов (сплайсинг ). При этом соединение экзонов одной и той же пре-мРНК может проходить разными способами, приводя к образованию разных зрелых мРНК, и в конечном итоге разных вариантов белка (альтернативный сплайсинг). Только мРНК, успешно прошедшая процессинг, экспортируется из ядра в цитоплазму и вовлекается в трансляцию.

2. Онтогенез - индивидуальное развитие особи - начинается с момента слияния

сперматозоида с яйцеклеткой и образования зиготы, заканчивается смертью.

Внутриутробная форма характерна для млекопитающих и человека. Все

функции зародыша осуществляются за счет организма матери, с помощью

специального органа – плаценты.

Яйцеклетка – крупная неподвижная клетка, обладающая за-па-сом питательных веществ. Размеры женской яйцеклетки составляют 150–170 мкм (гораздо больше мужских сперматозоидов, размер которых 50–70 мкм). Функции питательных веществ различны. Их выполняют:

1) компоненты, нужные для процессов биосинтеза белка (ферменты, рибосомы, м-РНК, т-РНК и их предшественники);

2) специфические регуляторные вещества, которые контролируют все процессы, происходящие с яйцеклеткой, например, фактор дезинтеграции ядерной оболочки

3) желток, в состав которого входят белки, фосфолипиды, различные жиры, минеральные соли. Яйцеклетка обычно имеет шарообразную или слегка вытянутую форму, содержит набор тех типичных органелл, что и любая клетка. Как и другие клетки, яйцеклетка отграничена плазматической мембраной, но снаружи она окружена блестящей оболочкой, состоящей из мукополисахаридов (получила свое название за оптические свойства). Блестящая оболочка покрыта лучистым венцом, или фолликулярной оболочкой, которая представляет собой микроворсинки фолликулярных клеток. Она играет защитную роль, питает яйцеклетку.Яйцеклетка лишена аппарата активного движения. За 4–7 суток она проходит по яйцеводу до полости матки расстояние, которое примерно составляет 10 см. Для яйцеклетки характерна плазматическая сегрегация. Это означает, что после оплодотворения в еще не дробящемся яйце происходит такое равномерное распределение цитоплазмы, что в дальнейшем клетки зачатков будущих тканей получают ее в определенном закономерном количестве.

Похожая информация.

© Разин С.В.

Пространственная организация ДНК

С.В. Разин

Сергей Владимирович Разин, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
заведующий лабораторией структурно-функциональной организации хромосом в Институте биологии гена РАН,
профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Еще в начале прошлого века благодаря использованию чисто генетических методов выяснилось, что гены линейно расположены на хромосомах. С тех пор большинство исследователей рассматривают геном как цепь последовательно расположенных генов и межгенных участков, включающих различные регуляторные и другие (казалось бы незначимые) последовательности. Такой стереотип мышления отражается, в частности, в том, что расстояния между генами или другими участками ДНК обычно указывают в тысячах нуклеотидных пар, имея в виду расстояния вдоль молекулы ДНК.

Хотя это вполне корректно, но такое представление о линейности генома заключает в себе определенные опасности. Дело в том, что в ядре эукариотической клетки геном упакован чрезвычайно сложно. В результате последовательности ДНК, в том числе и гены, отстоящие друг от друга на десятки или сотни тысяч нуклеотидных пар, а иногда и вообще расположенные в разных хромосомах, в трехмерном пространстве оказываются в непосредственной близости. Это обеспечивает взаимодействие белковых комплексов, связанных с удаленными (если считать вдоль молекулы ДНК) регуляторными элементами. Такие взаимодействия значительно расширяют возможности работы различных регуляторных систем в геноме эукариотической клетки. В последние годы получено несколько принципиально новых наблюдений, существенно повысивших интерес к пространственной организации ДНК в ядре. Мы попытаемся суммировать современные достижения в этой области.

Упаковка ДНК в ядре

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться.

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки осуществляется в несколько этапов (рис.1). Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы, при этом ее длина уменьшается в шесть-семь раз. Затем нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Далее фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз . Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Рис. 1. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки.

Пока речь шла лишь об упаковке одной протяженной молекулы ДНК. В первом приближении таковой можно считать ДНК одной хромосомы. Однако геном эукариотической клетки разделен на несколько хромосом. Например, в клетках любимого объекта генетиков - плодовой мушки дрозофилы - имеется четыре пары хромосом (в клетках человека их 46). Индивидуальные хромосомы можно увидеть под микроскопом только во время митоза. На остальных фазах клеточного цикла они не видны, и ядро клетки представляется относительно гомогенным. В течение многих лет молекулярных биологов интересовал вопрос, занимают ли отдельные хромосомы ограниченные пространства внутри ядра или же при декомпактизации хромосом ДНК каждой из них распределяется по всему ядру, неизбежно перемешиваясь с ДНК других хромосом.

Рис. 2. Окраска хромосомных территорий.

А - ДНК метафазных хромосом человека. Б - ДНК интерфазного ядра. В - ДНК метафазных хромосом (синий цвет) после гибридизации с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосому 18 (красный цвет) и хромосому 19 (зеленый цвет); показаны два гомолога соответствующей хромосомы. Г - результаты гибридизации ДНК интерфазных ядер с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосомы 18 и 19. Восемь секций ядра сделаны с помощью конфокального микроскопа; синим окрашена вся ядерная ДНК (как на рис.Б).

Около 10 лет назад ответ на этот вопрос был найден. Методы молекулярной гибридизации позволили окрашивать в интерфазном ядре индивидуальные хромосомы (рис.2). Оказалось, что они, вопреки общепринятой в то время точке зрения, занимают внутри ядра ограниченные неперекрывающиеся пространства (названные "хромосомными территориями", рис.3) и располагаются неслучайным образом: хромосомы, богатые генами, локализуются ближе к центру ядра, а бедные генами - ближе к его периферии . В поддержании специфических позиций хромосомных территорий важную роль играет ядерный матрикс.

Рис. 3. Двумерная и трехмерная модели ядра, показывающие расположение хромосомных территорий .

Взаимодействие удаленных регуляторных элементов

Упаковка ДНК в иерархические хроматиновые структуры принципиально важна для физического расстояния между регуляторными последовательностями и их ориентации в пространстве. А эти последовательности всегда служат площадками связывания регуляторных белков. Уже организация ДНК в нуклеосомы может сделать эти площадки недоступными для белковых факторов, либо ориентировать их так, что посаженные на них белковые комплексы в силу чисто стерических причин (например, направленности в противоположные стороны) не смогут взаимодействовать друг с другом. А при формировании фибрилл возможности подавления либо активации тех или иных регуляторных систем возрастают. Однако расположение нуклеосом на ДНК достаточно динамично. Обратимые изменения в их структуре и степени конденсации хроматина (в частности, переход от развернутой нуклеосомной нити к 30 нм фибрилле и более компактным гетерохроматиновым структурам) составляют наиболее изученную часть эпигенетических механизмов.

Эти механизмы мы не будем обсуждать, а остановимся на следующем уровне упаковки ДНК в хроматине, а именно на протяженных петлях ДНК (рис.1). Их можно увидеть при электронной микроскопии метафазных хромосом и интерфазных ядер, из которых были удалены гистоны. Наличие в интерфазных ядрах топологически замкнутых петель ДНК продемонстрировано и с помощью биохимических методов .

Прикрепленные к ядерному матриксу петли ДНК заинтересовали специалистов прежде всего потому, что по своим размерам они могли бы соответствовать функциональным единицам генома. Для проверки этого предположения требовалось изучить специфичность организации ДНК в петли. Во-первых, установить, одинаково ли разделение генома на петли во всех клетках. Если это предположение верно, то одни фрагменты генома всегда должны находиться в основаниях петель ДНК, а другие - в самих петлях. Во-вторых, выяснить, имеются ли некие особые последовательности ДНК, ответственные за "заякоривание" петель на белковом матриксе ядра.

Метод разрезания генома

За последние 30 лет предложено несколько методов картирования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу (хромосомному остову). Хотя эти методы различаются в деталях, их можно разделить на две принципиально различающиеся группы. Первая основана на выделении так называемой "прилежащей к ядерному матриксу ДНК" (т.е. находящейся в основаниях петель) и фракции петель ДНК, которая отщепляется от ядерного матрикса при ограниченной обработке ядер ферментом нуклеазой (рис.4). Предпочтительное присутствие исследуемого фрагмента ДНК в прилежащей ядерному матриксу фракции, полученной после достаточно интенсивной нуклеазной обработки, позволяет говорить о том, что он прикреплен к ядерному матриксу. Вторая группа методов направлена на изучение специфичности последовательностей ДНК, взаимодействующих с ядерным матриксом. В основе всех методов лежит избирательное связывание in vitro (т.е. в пробирке) фрагментов клонированной ДНК с изолированным ядерным матриксом. Однако результаты, полученные с помощью двух методических подходов, оказались достаточно противоречивыми .

Рис. 4. Схема установления позиций генов в петлях ДНК.

А - нуклеоид, полученный после экстракции гистонов из ядер, не обработанных нуклеазой; одна из петель ДНК содержит три гена: "a" находится в проксимальной (по отношению к ядерному матриксу) части петли, "b" занимает промежуточное положение, и "c" - в дистальной части;

Б - после обработки ядер нуклеазой образуются примерно два разрыва на петлю; фрагменты ДНК, находящиеся в основаниях петель (внутри пунктирного круга), прикреплены к ядерному матриксу. После дифференциального центрифугирования фрагменты разделяются, и в прикрепленной к ядерному матриксу ДНК остаются гены "a" и "b";

В - после дополнительной обработки нуклеазой остается только ген "а".

Мы обратили внимание, что все методы направлены на идентификацию и характеристику фрагментов ДНК, локализованных в основаниях петель. В основе нашего принципиально нового подхода лежит разрезание всего генома на петли и последующая их характеристика. На первый взгляд, разделить геном на индивидуальные петли чрезвычайно трудно. Здесь очень важно, с помощью какого инструмента делать разрывы в основаниях петель ДНК. По счастью, таким инструментом нас обеспечила сама природа. Исследования показали, что один из главных компонентов ядерного матрикса - фермент ДНК-топоизомераза II, регулирующий топологию ДНК. Этот фермент вносит двунитевые разрывы в ДНК, которые после снятия топологических напряжений либо разделения катенанов зашиваются (лигируются) тем же ферментом. На протяжении всей реакции фермент, состоящий из двух субъединиц, остается связанным с ДНК.

Существует целый ряд ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (в нашем случае VM-26), которые останавливают реакцию на стадии промежуточного комплекса фермент-ДНК. (Интересно, что большинство из них используются в качестве противоопухолевых агентов.) При этом каждая из субъединиц фермента остается ковалентно связанной с 5ў -концом разорванной цепи ДНК. Если такие блокированные комплексы обработать денатурирующим агентом, после чего разрушить фермент, то получится препарат ДНК, разрезанный на фрагменты в местах контакта ДНК с ферментом (рис.5). Если бы топоизомераза II находилась только в ядерном матриксе, то простая обработка живых клеток ее ингибиторами разрезала бы весь геном по участкам прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Однако задача осложняется тем, что этот фермент в растворимой форме присутствует в нуклеоплазме и может вносить разрывы в любом месте (если окажется рядом с ДНК в момент обработки клеток ингибитором). Наиболее вероятными точками разрывов будут свободные от нуклеосом участки, наиболее чувствительные к ДНК-нуклеазе (ДНКазе I). Чтобы исключить возможность разрывов вне интересующих нас участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу, мы экстрагировали растворимый фермент, а заодно и гистоны, обрабатывая ядра 2M NaCl (рис.4). Полученные так называемые нуклеоиды обрабатывали ингибиторами ДНК-топоизомеразы II . Так нам удалось разрезать весь геном на отдельные петли и их олигомеры.

Рис. 5. Схема метода картирования петель ДНК:

А - реакция, катализируемая ДНК-топоизомеразой II, и механизм разрезания ДНК при ингибировании сшивающей активности фермента VM-26 и другими "топоизомеразными ядами";

Б - разрезание геномной ДНК на индивидуальные петли. После удаления гистонов развернутые петли ДНК все еще прикреплены к ядерному матриксу (желтые кружки), содержащему ДНК-топоизомеразу II (фиолетовые кружки). Нуклеоиды инкубируют в среде с VM-26, после чего лизируют додецилсульфатом натрия (SDS). В местах прикрепления петель к ядерному матриксу топоизомераза II разрезает ДНК;

В - в петлях ДНК, обработанных рестриктазой Sfi I, появляются разрывы. Фрагмент Sfi I-Sfi I (показан синим цветом) можно идентифицировать с помощью гибридизации с пробой, комплементарной одному из концов полноразмерного рестриктного фрагмента (синяя стрелка). Справа тот же участок генома после дополнительного разрыва, вызванного топоизомеразой II (фиолетовый кружок). Размер укороченного фрагмента равен расстоянию от участка расщепления ДНК-рестриктазой Sfi I до участка расщепления ее топоизомеразой II;

Г - типичная картина результата электрофореза. На всех дорожках виден полноразмерный Sfi I-Sfi I фрагмент ДНК. В дорожках, содержащих ДНК из нуклеоидов, обработанных высокими концентрациями VM-26, появляется дополнительный (Sfi I-Тopo II) фрагмент, который свидетельствует, что внутри изучаемого фрагмента ДНК находится участок прикрепления к ядерному матриксу.

Что делать дальше? Как установить позиции концов петель на физической карте генома? Напомним, что на такой карте показаны реальные расстояния вдоль молекулы ДНК между теми или иными маркерами. Физические карты различных геномов начали создавать задолго до расшифровки геномов человека и ряда других организмов. В качестве маркеров при создании таких карт обычно используются участки расщепления ДНК ферментами рестриктазами. Установить позиции участка прикрепления петли ДНК к ядерному матриксу на физической карте - значит определить расстояние от места прикрепления до места расщепления ДНК той или иной рестриктазой. Для этого можно воспользоваться методом непрямого мечения концов фрагментов ДНК , предложенным около 30 лет назад для картирования позиций участков гиперчувствительности к ДНКазе I.

Принцип этого метода заключается в том, что после внесения в ДНК разрывов тем или иным агентом (в нашем случае - ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса) препарат дополнительно разрезают избранной рестриктазой. После разделения фрагментов с помощью электрофореза и переноса их на нитроцеллюлозный фильтр проводят гибридизацию с пробой, комплементарной концу вырезанного фрагмента, внутри которого может находиться дополнительный разрыв. Если такого разрыва нет, то после гибридизации получится полноразмерный фрагмент. Но если внутри этого фрагмента ДНК была разрезана топоизомеразой II ядерного матрикса или другим ферментом, фрагмент будет более коротким, и длина его равна расстоянию от участка расщепления ДНК рестриктазой до участка расщепления ДНК изучаемым агентом (рис.5). При работе с петлями, вырезанными ДНК-топоизомеразой II, основная трудность заключается в необходимости разделить по размеру очень длинные фрагменты ДНК. Эту проблему можно решить, используя электрофорез в пульсирующем поле, который позволяет разделить фрагменты ДНК с размерами от нескольких тысяч до нескольких миллионов нуклеотидных пар .

Карта организации в петли-домены гена дистрофина человека

Мы с успехом использовали вышеописанный метод для картирования границ петель в ряде областей генома человека и дрозофилы. После этого была поставлена масштабная задача - построить карту организации в петли-домены самого протяженного из известных генов - гена дистрофина человека. В этом гене, расположенном на Х-хромосоме, около 2500 тыс. нуклеотидных пар, а размер его мРНК составляет всего 14 тыс. нуклеотидных пар. Иначе говоря, более 99% от общей протяженности гена занимают некодирующие последовательности (интроны). В гене дистрофина часто происходят различные перестройки, некоторые из которых приводят к тяжелым наследственным заболеваниям - мышечным дистрофиям .

Рис. 6. Карта организации в петли гена дистрофина человека.

Вверху - схема расположения участков и областей прикрепления ДНК к ядерному матриксу (горизонтальные линии, обозначенные номерами 1-8) в границах гена дистрофина. Вертикальные стрелки (латинские буквы A-I) указывают на расположение участков расщепления; горизонтальные - на позиции гибридизационных проб.

Внизу - схема визуализации уникальных фрагментов ДНК на препаратах нуклеоидов. После экстракции из ядер гистонов петли ДНК расправляются и образуют корону вокруг ядерного матрикса (a). Препараты гибридизуют с пробами, содержащими биотин (жирная полоса на схеме б). Такую пробу можно увидеть после окраски антителами, связанными с флуоресцентным красителем (черные кружочки на схеме в).

Карту расщепления гена дистрофина рестриктазой SfiI построили еще до определения полной нуклеотидной последовательности генома человека. Мы картировали позиции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу относительно точек расщепления ДНК этой рестриктазой и выяснили, что в гене дистрофина имеется по меньшей мере девять петель, разделенных восьмью зонами прикрепления . В некоторых случаях протяженность участков ДНК, разделяющих две соседние петли, сопоставима с длиной самих петель (рис.6, а). Это принципиально новое наблюдение позволило рассматривать зоны прикрепления ДНК к ядерному матриксу как особую часть генома. Любопытно, что именно тут находятся выявленные ранее в гене дистрофина горячие точки рекомбинации . Обнаруженная закономерность оказалась справедливой и для ряда других изученных генов. Еще одно интересное наблюдение (также подтвержденное на других экспериментальных моделях) состоит в том, что в зонах прикрепления петель располагаются участки, с которых начинается репликация ДНК. Это подтверждает сформулированное нами еще 20 лет назад положение о важнейшем принципе организации эукариотической хромосомы - ее построении из структурно-функциональных доменов, соответствующих репликационным единицам .

Петли ДНК под микроскопом

Экспериментальный подход, использованный нами для картировании петель ДНК, основан на ряде логических предпосылок, вытекающих из радиально-петлевой модели строения хромосомы. До недавнего времени не было прямых доказательств того, что петли ДНК, картированные с помощью разных методов, именно те, которые можно видеть на цитологических препаратах. Среди множества переплетающихся петель ДНК, наблюдаемых под электронным микроскопом, практически невозможно идентифицировать петлю как фрагмент генома, интересующий исследователя. Однако это возможно при анализе петель с более низким разрешением.

Рис. 7. Микрофотографии результатов гибридизации in situ с препаратами ядерных гало (a) с фрагментом человеческого генома - петли ДНК, картированной в гене дистрофина. Эта петля ограничена областями прикрепления к ядерному матриксу 7 и 8. Гибридизация без конкурентной ДНК (б) и в присутствии избытка немеченной фракции повторяющихся последовательностей человеческой ДНК (в).

Если посмотреть на экстрагированные 2M NaCl ядра в флуоресцентном микроскопе (после окраски ДНК тем или иным флуоресцентным красителем), то можно видеть корону петель ДНК в виде облака, окружающего более ярко окрашенную центральную зону (ядерный матрикс) (рис.7, а и схемы на рис.6). Такие препараты называют ядерными гало (nuclear halos), на которых индивидуальные петли неразличимы. Чтобы увидеть их, надо воспользоваться методом гибридизации in situ (в данном случае препаратов иммобилизованных на стекле ядерных гало) с интересующим фрагментом генома. Проба должна содержать аналоги нуклеотидов (например биотинилированный уридин), которые после гибридизации окрашиваются флуоресцентными красителями, например красным или зеленым. Это позволяет одновременно анализировать распределение ДНК, которую проще всего окрасить DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндолом) в сиреневый цвет, и распределение пробы после гибридизации, окрашенной в красный или зеленый цвет.

В ходе реализации программы по секвенированию генома человека в разных лабораториях клонировали тысячи протяженных (100-300 тыс. нуклеотидных пар) фрагментов ДНК человека. Большинство клонов систематизировали соответственно позициям клонированных фрагментов ДНК в геноме человека. Существует целый ряд научных центров, в которых можно приобрести интересующий клон. Мы взяли клонированный фрагмент человеческой ДНК, представляющий картированную нами в гене дистрофина петлю ДНК, ограниченную участками прикрепления 7 и 8 (см. рис.6). После гибридизации этого фрагмента с препаратами ядерных гало выявляется множество сигналов, распределенных по всему полю (рис.7, б). Это связано с тем, что в ДНК высших эукариот, в том числе и человека, присутствует множество повторяющихся последовательностей, распределенных по всему геному.

Имеющиеся в нашей пробе повторы гибридизуются со всеми комплементарными последовательностями. Понятно, что результаты такого эксперимента не поддаются интерпретации. К счастью, сигналы от гибридизации повторяющихся последовательностей можно подавить. Для этого мы провели гибридизацию в присутствии избытка немеченой фракции повторяющихся последовательностей ДНК человека и увидели петли ДНК, прикрепленные к ядерному матриксу (рис.7, в). Все они имели одинаковый размер (в пределах погрешности измерений), соответствующий длине фрагмента ДНК, картированного в экспериментах по вырезанию петель ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса .

Значение этого результата выходит за рамки простого подтверждения правильности построенной нами карты доменной организации гена дистрофина. Впервые в мире мы показали, что биохимический метод, основанный на радиальной модели строения хромосомы, действительно позволяет картировать петли ДНК, наблюдаемые на цитологических препаратах. Это подтверждает и радиальную модель строения хромосомы, на основании которой разработан наш метод вырезания петель. Далее, возможность наблюдать одинаковые петли ДНК при анализе ряда препаратов ядерных гало подтверждает тот факт, что ДНК организована в петли статично, т.е. во всех клетках к ядерному матриксу прикреплены одни и те же фрагменты ДНК, а участки между ними образуют петли. Мы поставили эксперимент на активно делящихся клетках. Коль скоро во всех клетках выявлены одинаковые петли ДНК, можно утверждать, что специфическая организация ДНК в петли, разделенные зонами прикрепления, сохраняется в ряду клеточных делений. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку позволяет рассматривать такую организацию ДНК как один из эпигенетических механизмов. Действительно, при образовании петель могут фиксироваться позиции различных регуляторных элементов и их мишеней, способствуя их взаимодействию либо, наоборот, исключая его.

Петли ДНК, хромосомные перестройки и эволюция генома

Как мы уже говорили, горячие точки рекомбинации гена дистрофина находятся в сегментах, прикрепленных к ядерному матриксу. Дополнительные исследования показали, что к ядерному матриксу прикреплены и горячие точки рекомбинации, присутствующие в ряде других генов, в частности тех, рекомбинации которых ассоциированы с развитием лейкозов . Трудно поверить, чтобы это было просто случайным совпадением. Скорее всего, именно постоянный контакт ДНК с топоизомеразой служит причиной возникновения "горячих точек" хромосомных перестроек. Топоизомераза II может прямо участвовать в незаконной рекомбинации. Еще более вероятно, что внесенные ею двунитевые разрывы в ДНК при определенных условиях могут стимулировать неточное восстановление этих повреждений.

Известно, что репарация двунитевых разрывов в ДНК высших эукариот нередко приводит к различным рекомбинационным событиям. На возможную роль топоизомеразы II как индуктора хромосомных перестроек указывают многочисленные данные о том, что использование ингибиторов этого фермента в химиотерапии опухолей нередко вызывает вторичные лейкозы . Клетки этих лейкозов характеризуются различными крупномасштабными хромосомными изменениями, наиболее частыми в участках расщепления ДНК-топоизомеразой II . Важно отметить, что участки прикрепления петель на молекуле ДНК располагаются достаточно далеко друг от друга, но внутри ядра они могут оказаться в непосредственной близости. Незаконная рекомбинация между такими участками будет приводить к утрате либо перемещению протяженных участков генома, что, в свою очередь, может быть важным фактором эволюции генома .

Литература

1. Getzenberg R.H., Pienta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.47. P.289-299.

2. Cremer T., Kurz A., Zirbel R., Dietzel S. et al. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.777-792.

3. Peterson C.L., Laniel M.A. // Curr. Biol. 2004. V.14. P.R546-551.

4. Razin S., Gromova I.I., Iarovaia O.V. // International Review of Cytology. 1995. V.162B. P.405-448.

5. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.25-35.

6. Nedospasov S.A., Georgiev G.P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V.92. P.532-539.

7. Schwartz D.C., Cantor C.R. // Cell. 1984. V.37. P.67-75.

8. Hoffman E.P., Schwartz L. // Mol. Aspects Med. 1991. V.12. P.175-194.

9. Iarovaia O.V., Bystritskiy A., Ravcheev D., Hancock R. et al. // Nucl. Acids. Res. 2004. V.32. P.2079-2086.

10. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K. et al. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P.8189-8207.

11. Iarovaia O.V., Shkumatov P., Razin S.V. // J. Cell. Sci. 2004. V.117. P.4583-4590.

12. Super H.J., McCabe N.R., Thirman M.J., Larson R.A. et al. // Blood. 1993. V.82. P.3705-3711.

13. Zhang Y., Strissel P., Strick R., Chen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P.3070-3075.

14. Razin S.V. // Crit. Rev. Eukar. Gene Exp. 1999. V.9. P.279-283.

Молекулы ДНК в эукариотических хромосомах очень велики. Длина молекул ДНК, выделенных из клеток дрозофилы, достигает 1,2 см, и принято считать, что каждая эукариотическая хромосома содержит одну-единственную непрерывную молекулу ДНК. Упаковка таких огромных молекул в ядрах клеток является основной функцией гистонов, белков, характерных именно для эукариотических клеток.

Основная структурная единица эукариотической клетки - это нуклеосома (рис. 4.18). Нуклеосома содержит по две молекулы каждого из четырех гистонов, Н2А, Н2В, НЗ и Н4, соединенных в форме октамера. Каждый октамер связан с последовательностью из примерно 200 нуклеотидных пар длиной около 700 А. Точное взаимное расположение

4. Природа генетического материала 117

гистона и ДНК в нуклеосоме неизвестно, но считается, что ДНК каким-то образом наматывается на октамеры гистона. Нуклеосома имеет диаметр около 100 Å, и таким образом ДНК в нуклеосоме должна быть сложена примерно всемеро. Другой гистон, HI, обеспечивает связь между нуклеосомами, последовательность которых образует подобие винта (рис. 4.19). Диаметр этого винта (называемого соленоидом) составляет по одним оценкам около 300 Å, по другим -около 500 Å. Это различие, вероятно, обусловлено тем, что для приготовления электронно-микроскопических препаратов использовали разные методы. Если принять диаметр соленоида равным 300 Å, то упаковка последовательности нуклеосом в форме соленоида дает дополнительное уменьшение линейных размеров структуры в целом еще в 6 раз. В интерфазных хромосомах сам соленоид закручен винтом, образуя при этом полую трубку диаметром около 2000 Å, что дает очередное сокращение линейных размеров содержащей ДНК структуры еще примерно в 18 раз (рис. 4.20).

Переход от интерфазной хромосомы к метафазной хроматиде, вероятно, связан с еще одним аналогичным закручиванием теперь уже трубки диаметром в 2000 Å в винтовую структуру диаметром около 6000 Å (рис. 4.20). Эта общая схема организации ДНК в ядрах клеток игнорирует различия в степени спирализации, которые почти наверняка существуют между теми участками хромосом, которые участвуют в синтезе РНК и репликации ДНК, и теми, которые в этих процессах не участвуют. Кроме того, гетерохроматиновые участки хромосом более компактны, чем эухроматиновые. В любом случае ДНК в ядрах эукариотических клеток образует иерархическую систему спиралей, основной единицей которой является нуклеосома.

Хромосомы прокариотических клеток представляют собой кольцевые молекулы ДНК; у Е. coli длина кольца составляет 10 7 Å, т.е. около 1 мм. Эта огромной длины кольцевая нить помещается в клетке

Рис. 4.20. Пространственные модели интерфазной и метафазной эукариотической хромосомы. А. Схематическое изображение винтовых структур, начиная от двойной спирали Уотсона - Крика диаметром 20 Å ; далее нуклеосома - 100 Å, соленоид - 300 Å, трубка- 2000 Å и, наконец, метафазная хроматида - 6000 Å. Б. Пространственная модель двух последних уровней организации метафазной хроматиды, сделанная из проволоки. Тончайшие белые поперечные линии на проволоке (указаны белой стрелкой) представляют двойную спираль Уотсона -Крика диаметром 20 Å, белая черта указывает диаметр соленоида (300 Å), черная –диаметр трубки (2000 Å). В. Модель метафазной хромосомы в меньшем масштабе, чем на Б (черная черта по-прежнему обозначает 2000 Å). Тончайшие белые линии (слева) означают последовательность нуклеосом диаметром 100 Å, закрученную в соленоид диаметром 300 Å; последние уровни иерархии - трубка диаметром 2000 Å и хроматида - 6000 А. Участок трубки диаметром 2000 А в середине рисунка - это центромера, соединяющая два плеча метацентрической хромосомы.

4. Природа генетического материала 119

длиной лишь 2·10 4 Å при диаметре около 8·10 3 Å. Следовательно, ДНК может существовать в клетке лишь в высокоупорядоченном (конденсированном) состоянии. Хотя в прокариотических клетках нет белков гистонов, в них тем не менее содержатся некоторые белки, образующие комплексы с ДНК. При электронной микроскопии разрушенных определенным образом клеток Е. coli можно видеть, что ДНК собрана в «бусины», по величине очень близкие нуклеосомам эукариот (рис. 4.21). Эти

120 Организация и передача генетического материала

бусины очень лабильны, что указывает на то, что взаимодействие между ДНК и белками в клетках Е. coli много слабее, чем между ДНК и гистонами эукариот. Характер иерархической конденсации хромосомы Е. coli не вполне понятен, но хромосома в целом может быть выделена в виде компактной структуры, называемой нуклеоидом.

Не вся ДНК эукариотических клеток находится в ядрах клеток. Митохондрии и недифференцированные хлоропласты растений, так называемые пластиды, представляют собой самореплицирующиеся органеллы и содержат собственные кольцевые молекулы ДНК. Эти молекулы очень невелики и кодируют ограниченное количество информации, необходимой для осуществления органеллами их функций. Так же как и хромосомы прокариот, они не связаны с гистонами и образуют внутри органелл нуклеоиды.

Четвертичная структура ДНК. Хромосомы

Четвертичная структура ДНК – это укладка нуклеосом в хроматин, так что молекула ДНК длинной в несколько сантиметров складывается до 5 нм. Хроматин на окрашенных препаратах клетки представляет собой сеть тонких тяжей (фибрилл), мелких гранул или глыбок. Основу хроматина составляют нуклеопротеины – длинные нитевидные молекулы ДНК (40%), соединенные со специфическими белками – гистонами (40%). Гистоны – это основной класс нуклеопотеинов, ядерных белков, необходимых для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы. Существует пять различных видов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4. Гистоны обогащены аминокислотами с положительно заряженными (аргинин, лизин) и гидрофобными (валин и т.п.) радикалами. При этом благодаря радикалам аргинина и лизина гистоны взаимодействуют с ДНК, а благодаря гидрофобным радикалам друг с другом. Гистоны выполняют важную структурообразующую функцию.

В состав хроматина входит также РНК, кислые белки (вероятно кислые белки тоже играют структурную роль, участвуя в образовании высших, наднуклеомерных, уровней укладки хромосом), липиды и минеральные вещества (Ca²+ и Mg²+), а также фермент ДНК-полимераза, необходимый для репликации ДНК. В процессе деления ядра нуклеопротеины спирализуются, укорачиваются, в результате уплотняются и формируются в компактные палочковидные хромосомы, которыестановятся заметны при наблюдении в световой микроскоп. Хромосома – это наиболее компактная форма наследственного материала клетки (по сравнению с нитью ДНК укорочение составляет примерно 1600 раз). У большинства эукариот ДНК скручивается до такой степени только на время деления.

Строение хромосом. У каждой хромосомы имеется первичная перетяжка – центромера (утонченный неспирализованный участок), которая делит хромосому на два плеча. В области первичной перетяжки располагается фибриллярное тельце – кинетохор, который регулирует движение хромосом при клеточном делении: к нему прикрепляются нити веретена деления, разводящие хромосомы к полюсам.

Рис. 1. Строение хромосомы: 1 – первичная перетяжка (ценромера); 2 – плечи хромосомы; 3 – молекулы ДНК; 4 – теломеры

В зависимости от расположения перетяжки выделяют три основные вида хромосом:

1. Равноплечие – с плечами равной длины;

2. Неравноплечие – с плечами неравной длины;

3. Одноплечие (палочковидные) – с одним длинным и другим очень коротким, едва заметным плечом.

Рис. 2. Основные виды хромосом: 1 − равноплечие хромосомы; 2 – неравноплечие хромосомы; 3 – одноплечие хромосомы

Вторичная перетяжка – ядрышковый организатор, содержит гены рРНК, имеется у одной – двух хромосом в геноме. Этот участок хромосомы контролирует синтез ядрышка.

Теломеры – концевые участки хромосом, содержащие до 10 тысяч пар нуклеотидов с повторяющейся последовательностью ТТАГГГ. Теломеры не содержат генов, они:

· защищают концы хромосом он действия нуклеаз – ферментов, разрушающих ДНК.

· обеспечивают прикрепление концов хромосом изнутри к ядерной оболочке.

· защищают гены от концевой недорепликации.

Каждой клетке того или иного вида живых организмов свойственны определенные число, размеры и форма хромосом. Совокупность хромосом соматической клетки, типичной для данной систематической группы грибов, животных или растений, называют хромосомным набором или кариотипом.

Число хромосом в зрелых половых клетках называют гаплоидным набором и обозначают буквой n . Соматические клетки содержат двойное число хромосом (диплоидный набор), обозначаемое как 2n . Клетки, имеющие более двух наборов хромосом, являются полиплоидными (4n, 8n и т.д.). Парные хромосомы, то есть одинаковые по форме, структуре и размерам, но имеющие разное происхождение (одна материнская, другая отцовская), называются гомологичными.

22 ноября 2016 в 12:53

ДНК составляет лишь половину объёма хромосом. Всё остальное - оболочка неизвестной функциональности

• Научно-популярное ,
• Биотехнологии

В школе нас учили, что в ядре каждой клетки содержатся нитевидные структуры под названием хромосомы, в которых хранятся гены - единицы наследственности, расположенные в линейном порядке. Гены закодированы в составе макромолекулы ДНК. Но всё не так просто, как кажется.

С самого момента своего открытия в 1882 году хромосомы подверглись тщательному и пристальному изучению, в том числе с помощью оптических и электронных микроскопов. Удивительно, но учёным до сих пор не удаётся чётко понять, как организована их структура.

Десятилетиями учёные концентрировали свои усилия на исследовании, в основном, хроматина. Это основное функциональное вещество хромосом, представляющее собой комплекс ДНК, РНК и белков. Именно в составе хроматина происходит реализация генетической информации, а также репликация и репарация ДНК.

Одна из главных загадок - как происходит упаковка (фолдинг) хроматина. Долгое время предполагали, что упаковка происходит случайным образом, но в последнее время появились другие теории. Некоторые учёные предполагают, что упаковка происходит по образцу расплава полимера . Есть мнения, что хромосомы проходят через цепочку взаимосвязанных процессов упаковки, от винтовой навивки вокруг нуклеосомы , до соленоидального 30 нм волокна, а затем к спирали большего размера . В конце концов, есть третий класс теорий, которые предполагают, что хромосомы состоят из петель хроматина, сдерживаемых негистонными белками .

Последняя из перечисленных моделей структуры хромосомы в последнее время получила дополнительное подтверждение. В 2013 году продвинутые методы микроскопии наглядно показали, каким образом в ядре клетки образуется линейная матрица из хроматиновых петель (см. работу Натальи Наумовой из Университета Массачусетса с коллегами, опубликованную в журнале Science ). На видео более показано, как происходит самоорганизация хромосом.

Организация митотических хромосом (сопроводительный материал к статье Натальи Наумовой с коллегами 2013 года)

Впрочем, все эти исследования хроматина по большому счёту игнорировали тонкий поверхностный слой, который на хромосомах обнаружили ещё методом классической микроскопии в 1968 году . Этот периферийный слой исследовали слабо, а его состав и строение оставались практически неизвестными. По умолчанию предполагалось, что это просто некая аморфная масса, которая прилипла к хромосомам.