Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тйга), гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl2, раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия (среда Бенгсанга-Эллиота).

Среды обогащения для бактерий

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци , селенитовый бульон, тиогликолятная среда ) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества - соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К, антибиотики, фуксин, гендиановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Элективные и селективные питательные среды для выращивания бактерий

Элективные и селективные среды (например, среды Уилсона-Блэра, Эндо, Плоскирева, Мак-Конки ) предназначены для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды (например, Леффлера, Борде-Жангу ), яичные среды (например, Левенштайна-Йенсена) и др.

Эти методы применяются для определения микроорганизмов, которые содержатся в пищевых продуктах в незначительных количествах. Для количественного учета таких микробов вначале следует накопить их на элективных жидких или плотных питательных средах, а затем идентифицировать на плотных дифференциально-диагностических питательных средах. Поэтому определение таких микроорганизмов проводят в два этапа. На первом этапе выясняют, содержатся ли эти микроорганизмы в определенном количестве продукта, в котором их быть не должно согласно санитарным нормам. При обнаружении микроорганизмов производят их идентификацию.

Определение бактерий группы кишечной палочки. На первом этапе делают посевы нужного количества продукта в пробирки со средой Кесслер, которая является накопительной для БГКП. Термостатирование посевов осуществляют при температуре 37 о С в течение 18-20 часов. БГКП сбраживают лактозу, которая входит в состав среды Кесслер, с образованием кислоты и газа. Газ скапливается в поплавках и свидетельствует о наличии БГКП в данном количестве продукта.

На втором этапе материал из пробирок с газом пересевают петлей в чашки с дифференциально-диагностической средой Эндо (посев делают штрихом). Посевы инкубируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. БГКП на среде Эндо образуют колонии или налет красного цвета с характерным металлическим блеском. Из типичных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках выявляют мелкие бесспоровые грамотрицательные палочки, то делают вывод о фекальном загрязнении продукта.

Определение сальмонелл. Для обнаружения сальмонелл на анализ берут достаточно большое количество продукта (25, 50 г). Продукт измельчают в ступке со стерильным песком и вносят в колбы со 100 мл жидкой накопительной среды: Кауфмана, хлористомагниевой «М» или селенитовой. Посевы культивируют при температуре 37 о С в течение 18-20 часов. При наличии помутнения среды делают пересев на среду Эндо, растирая материал шпателем на поверхности среды. Посевы инкубируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. Сальмонеллы на среде Эндо образуют бесцветные или сероватые колонии.

Определение анаэробных сульфитредуцирующих клостридий. Данный анализ ведут в два этапа. На первом этапе производят накопление указанных микроорганизмов на элективной среде Китт-Тароцци. Делают посев 1 мл из 2-го разведения (доза продукта - 0,01 г) в нижнюю часть пробирки со средой и помещают в термостат с температурой 37 о С на 24-48 часов. Признаком роста является помутнение среды, образование осадка, пены. Если обнаружен рост, то затем производят идентификацию выделенных бактерий. В данном количестве продукта хорошего качества анаэробных клостридий быть не должно.

Определение бактерий рода протея. Палочки протея определяют методом Шукевича, основанном на их высокой подвижности. В коденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара вносят 1-2 капли взвеси из первого разведения продукта, не касаясь поверхности агара. Пробирки с посевами термостатируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. Палочки протея быстрее других вползают на поверхность агара, образуя нежный голубоватый вуалеобразный налет. При микроскопии препарата из верхней части налета обнаруживаются бесспоровые грамотрицательные палочки. Для выделения чистой культуры с целью дальнейшего исследования производят пересев бактерий из верхней части налета в пробирку со скошенным МПА.

2.ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Изучить микробиологические показатели исследуемого продукта и составить схему проведения анализа.

2. Взвесить пробы продукта, растереть в ступках со стерильным песком и приготовить нужное количество разведений.

3. Сделать посевы для определения нормируемых микробиологических показателей.

Цель работы : определение микробиологических показателей исследуемого продукта и оценка его качества. Изучение свойств выделенных микроорганизмов и идентификация их.

1. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Изучение посевов и оценка качества продукта . В чашках с посевами производится подсчет выросших колоний. Подсчет ведут со стороны дна чашек в проходящем свете, отмечая каждую колонию карандашом, причем каждая отдельная колония принимается за одну клетку. Полученные цифры умножаются на показатели разведения продукта, и таким образом получается количество микроорганизмов в 1 г (КМАФАнМ), которое сравнивается с нормативами.

Рост бактерий группы кишечной палочки на среде Кесслер характеризуется появлением газа в поплавках. Это связано с тем, что БГКП сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа.

В чашках с молочно-солевым агаром следует обратить внимание на наличие колоний круглой формы золотистого или белого цвета с гладкой блестящей поверхностью, с зонами просветления вокруг, характерных для стафилококков. В посевах для определения сальмонелл и анаэробных клостридий признаком роста является помутнение среды, на что следует обратить внимание.

Необходимо проанализировать результаты посевов и оценить качество исследуемого продукта по соответствию полученных результатов нормативным микробиологическим показателям.

Изучение качественного состава микрофлоры продукта . В чашках с посевами, содержащими изолированные колонии микроорганизмов, следует определить их видовую принадлежность. Для этого необходимо изучить морфологические, культуральные, ферментативные свойства выделенных микробов.

Выделенные колонии рассматривают на свету с помощью лупы и описывают по следующим признакам:

Форма колоний (круглая, эллипсоидная, неправильная и т.д.);

Размер колоний (крупные - более 5-ти мм; средние - 3-5 мм; мелкие - 1-3 мм; точечные - менее 1-го мм);

Цвет колоний; у бактерий, не образующих пигменты, колонии имеют серовато-матовый оттенок;

Рельеф колоний (выпуклые, плоские, стелющиеся и др.);

Характер края (ровный, волнистый, бахромчатый и др.);

Характер поверхности (гладкая, блестящая, матовая, тусклая, морщинистая, шероховатая, зернистая и др.);

Прозрачность (прозрачная, непрозрачная, полупрозрачная);

Консистенция (маслянистая, тягучая, пленчатая, крошащаяся).

Для описания морфологических свойств из изолированных колоний готовят мазки, окрашивают по методу Грама и изучают под микроскопом. Следует обратить внимание на форму клеток, их взаимное расположение, наличие спор, капсул, результат окраски по Граму. При необходимости можно использовать и другие методы окраски микроорганизмов.

С целью дальнейшего исследования свойств микроорганизмов производят пересев в пробирки на скошенный МПА.

На основе исследованных свойств ориентировочно определяют род или вид выделенных культур микроорганизмов, используя «Краткий определитель бактерий Берги».

2. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Внимательно осмотреть чашки и пробирки с посевами, отметить признаки роста на разных питательных средах.

3. Оценить качество продукта по микробиологическим показателям, сравнивая полученные данные с нормативами.

4. Изучить культуральные и морфологические признаки выделенных микроорганизмов и определить их род.

Контрольные вопросы

1. Дайте характеристику микробиологическим критериям безопасности пищевых продуктов.

2. Что такое КМАФАнМ? С какой целью определяют этот показатель и каким методом?

3. Что такое БГКП? С какой целью определяют этот показатель и каким методом?

4. Какие условно-патогенные микроорганизмы определяют в мясных продуктах?

5. Какие патогенные микроорганизмы определяют в мясных продуктах?

6. Как производится отбор образцов продуктов для исследования микрофлоры?

7. Как производится подготовка проб для исследования?

8. В каких документах содержатся микробиологические показатели пищевых продуктов?

Лабораторная работа № 3

Санитарно-микробиологический контроль

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.

2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные ).

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь, гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl 2 , раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия.

Среды обогащения для бактерий

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества - соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Также по назначению различают среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.

Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желчный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.

Желчный бульон . К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.

Селенитовый бульон . Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.

Среда Плоскирева . Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.

Пептонная вода . Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для холерных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.

Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.

2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения различных сахаролитических ферментов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розоловой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.

Примеры дифференциально-диагностических сред:

Среда Эндо . Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд . Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Питательные среды являются основой бактериологических исследований. Они служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов, для изучения их свойств. На питательных средах создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. В состав сред должны входить вещества, необходимые для построения всех компонентов цитоплазмы, т.е. все источники роста живого организма. Сюда, в первую очередь, относятся источники азота, углерода, водорода и кислорода.

Источник водорода и кислорода в питательных средах - вода. Источником азота служат органические соединения, которые получают из мяса, рыбы, плаценты, молока, яиц, крови. В результате гидролиза панкреатином или трипсином из этих продуктов получаются т.н. гидролизаты, содержащие большое количество аминокислот и пептонов, которые хорошо усваиваются большинством микроорганизмов. Нативный белок усваивают только некоторые микроорганизмы, имеющие экзопротеазы. Гидролизаты являются основой для приготовления сред для многих микроорганизмов.

Источником углерода для патогенных микробов являются, главным образом, различные углеводы: моно- и дисахара, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Кроме органогенов, бактериям необходимы неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, а также микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др.

Потребность микроорганизмов в неорганических соединениях удовлетворяется прибавлением к питательной среде солей КН2РO4 К2НРO4 и др. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими элементами, многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста, т.е. в веществах, которые они сами не могут синтезировать. Факторы роста необходимо добавлять в питательные среды в готовом виде. К факторам роста относятся различные витамины, источником которых в питательных средах являются прибавленные к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества микробами могут усваиваться только при определенной реакции среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.

2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. -

3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).

5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.

Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина! Агар-агар (по-малайски - желе) - продукт растительного происхождения, добывается из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, затвердевает при 36-40 , и поэтому используется для уплотнения питательных сред для выращивания разных групп микроорганизмов при оптимальной для них температуре.

Классификация питательных сред производится по их составу и назначению

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

2.Ко второй группе относятся среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.

Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет провялятся рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желточный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.

Желточный бульон. К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.

Селенитовый бульон. Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.

Среда Плоскирева. Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.

Пептонная вода. Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для хлорных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.

Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).

Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ». По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.

2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для

обнаружения различных сахаролитических ферментов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розовой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.

Примеры дифференциально-диагностических сред:

Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозонозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО2, СН4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

Сухие среды.

Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.

Классификация питательных сред:

Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. Например: овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца и т.д. (МПА, МПБ).

Полусинтетические – в состав входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава. Например: МПБ с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро.

Синтетические – содержат только химически чистые соединения в точных концентрациях. Применяют в лабораторных экспериментах. Например: среда Чапека, Омелянского, Ушинского и т.д.

Назначение питательных сред

Универсальные (общего назначения)- пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда.

Специальные применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие.

1. Элективные среды - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.

2. Селективные - благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).

3. Дифференциально-диагностические - группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).

4. Консервирующие (траспортные)-

предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия

биоматериала до посева для диагностики

Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов

Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов

Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения

Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)

Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред

Транспортная система со средой Стюарта

Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.

Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.

Транспортная система со средой Кери Блэйр

Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.

Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,

удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.

Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp .

Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.

Транспортная система со средой Эймса

Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets .) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.

Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.

В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.

Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.

Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)

Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.

Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.

Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера

Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.

Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.

Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона

Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.

Среда МакКонки

Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.

Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.

Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.

Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.

Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо

Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.

Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.

Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар

Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.

Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.

Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.

Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар

Селективная среда для выделения сальмонелл.

Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.

Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.

Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.

Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.

Специальные элективные среды: Среда Леффлера

Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.

Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.

Специальные селективные среды: Кампилобакагар

Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.

Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni .

Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.

Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.

Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.

На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение