Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Простые методы окраски

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Сложные методы окраски

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных - он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% - 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% - 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах, концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Окраска бактерий по Граму - сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

Окрасы

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

Подготовка материала

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окрашивание

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

1. Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
2. Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
3. Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
4. Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.

Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

Результаты

Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы - отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках - пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные - обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

Применение

Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты — все о путешествиях на сайт

Цель: позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки, определить морфологические и тинкториальные свойства.

1. Приготовить фиксированный мазок

2. На мазок кладём фильтровальную бумагу

3. На бумагу капнуть 1-2 капли генцианвиолета и окрасить в течение 1 минуты

4. Краску вместе с бумагой смыть (промывать водой не надо)

5. Окрасить препарат раствором Люголя на фильт. бумаге в течение 1 минуты

6. Краску слить и на мазок с фильтр. Бумагой капнуть на 0,5 минуты этилового спирта

7. Промыть препарат водой

8. Окрасить разведённым фуксином Циля в течение 2 минут также на фильтровальной бумаге

9. Промыть водой, подсушить и промикроскопировать

Грам «+» окрашиваются в синий цвет, грамм «-» в розовый.

Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде.

Приготовить рабочий стол → Зажечь спиртовку и прокалить бактериальную петлю → Петлёй нанести на предметное стекло каплю воды → Петлю обжечь → Петлёй взять небольшое количество исследуемого материала, соблюдая правила стерильности → Перенести материал в каплю воды на предметном стекле и тщательно растереть, чтобы получилось мутное пятно → Петлювновь обжечь → Зафиксировать мазок, проведя над пламенем 3-4 раза → Дать мазку подсохнуть → Окрасить.

Дайте характеристику ГР(+) и ГР(-) бактериям.

Отличия ГР(+) и ГР(-) бактерий

Отношение к окраске по Граму – важный для систематики признак бактерий, который зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. Выделяют две большие группы - грамположительные (“грам+”) и грамотрицательные (“грам-“) бактерии. Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода с генциановым фиолетовым (окрашены в сине-фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий.

Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС), часто нет диаминопимелиновой кислоты.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно - имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная.

2. Укажите на предложенной чашке с ЖСА один из дифферинциально-диагностических признаков.

Назовите признак, являющиеся дифференциально-диагностическими для стафилококков.

Дифференциально – диагностический признак: при росте стафилококки образуют пигмент: золотистый лимонно-желтый или белый, который не растворяется в воде и растворяется в ацетоне, эфире, спирте.

На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. На агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. На бульоне – равномерное помутнение и осадок на дне.

На ЖСА вокруг колоний выявляется продукция лецитиназы - мутная зона и «радужные» венчики.

3. Через 10 лет после перенесенного сыпного тифа у больного без повторного заражения появились симптомы этого заболевания. Назвать это явление и используемые методы диагностики.

Рецидив - повторение болезни после кажущегося полного выздоровления.

Основным методом лабораторной диагностики сыпного тифа являются серологические реакций: агглютинации, связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. Реакция агглютинации со специфическим диагностикумом из риккетсий Провачека высокочувствительна и становится положительной на 3-5-й день. Диагностическим титром антител считают разведение сыворотки 1: 100-1: 160. Антитела исчезают в течение года после заболевания. РСК бывает положительной с 7-8-го дня болезни; титр антител максимальный к 12-14-му дню, а затем наблюдается медленное снижение. Небольшое количество комплемент- связывающих антител обнаруживают долгие годы. РНГА становится положительной на 7-8-й день заболевания. Диагностическим считают титр антител 1: 160 - І : 200 при условии его дальнейшего нарастания при повторной постановке РНГА.

БИЛЕТ 5

1. Окрасьте препарат метиленовой синью, промикроскопируйте, сделайте вывод.

Расскажите методику приготовления мазка из культуры, выращенной на ЖПС.

Окрасить препарат метиленовой синью:

1. препарат положить на поверхность исследуемым материалом вверх;

2. пипеткой нанести на препарат р-р красителя на 5-7 мин;

3. краску слить, промыть водой;

4. просушить;

5. м/с с иммерсией.

Для приготовления мазка необходимо иметь:

Чистое обезжиренное предметное стекло.

Бактериологическую петлю

Культуру, выращенную на плотной питательной среде - агаре, или жидкой среде - бульоне.

Спиртовку.

Набор красок.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.

2.Выберите культуры с характерным для сальмонелл ростом на двухсахарной среде.

Перечислите и охарактерактеризуйте исследования для дифференциации этого возбудителя.

3.У больного был взят мазок из зева и посеян на питательную среду. Для фаготипирования был использован стафилококковый бактериофаг, но зоны подавления роста через 24 часа инкубации не появилось.

Дать заключение по этим данным.

БИЛЕТ 6

1.Промикроскопитуйте готовый препарат, сделайте вывод.

Расскажите устройство и правила работы со световым микроскопом.

При работе с микроскопом необходимо соблюдать операции в следующем порядке:

1. Работать с микроскопом следует сидя;

2. Микроскоп осмотреть, вытереть от пыли мягкой салфеткой объективы, окуляр, зеркало;

3. Микроскоп установить перед собой, немного слева на 2-3 см от края стола. Во время работы его не сдвигать;

4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее положение;

5. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения;

6. Опустить объектив 8 х в рабочее положение, т. е. на расстояние 1 см от предметного стекла;

7. Глядя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зрения;

8. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм;

9. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины;

10. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа;

11. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6, 7, 8, 9;

12. Для изучения объекта при большом увеличении сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. Затем поменять объектив на 40 х, поворачивая револьвер, так чтобы он занял рабочее положение. При помощи микрометренного винта добиться хорошего изображения объекта. На коробке микрометренного механизма имеются две риски, а на микрометренном винте - точка, которая должна все время находиться между рисками. Если она выходит за их пределы, ее необходимо возвратить в нормальное положение. При несоблюдении этого правила, микрометренный винт может перестать действовать;

13. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.

2. Произведите учет реакции связывания комплемента (Реакция Вассермана). Назовите цель проводимой реакции и перечислите используемые ингредиенты.

Реакция Вассермана (RW), или ЭДС (экспресс-диагностика сифилиса) - метод диагностики сифилиса

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: 1) исследуемая сыворотка, 2) антигены, 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Все ингредиенты для реакции Вассермана берут в одинаковом объеме - 0,5 или 0,25 мл.

Степень положительности реакции Вассермана принято обозначать количеством крестов + + ++ полная задержка гемолиза, жидкость не окрашена, все эритроциты в осадке; + + + выраженная задержка гемолиза, жидкость розовая, эритроциты в осадке; + + частичная задержка гемолиза, жидкость окрашена интенсивно, осадок эритроцитов ясно виден; + слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно окрашена, осадок незначительный, слабо заметен; - полный гемолиз, жидкость окрашена интенсивно, осадка нет

3. В микробиологическую лабораторию поступил материал – биоптат со слизистой желудка с клиническим диагнозом: язвенный гастродуоденит. При посеве исследуемого материала была выделен - H. PYLORI.Методы микробиологического исследования используемые для анализа данной пробы.Методика взятия биоптата со слизистой желудка и 12 – перстной кишки.

ПЦР обычно дает положительный (возбудитель есть) или отрицательный результат (возбудителя нет). Метод ПЦР позволяет выявить даже ничтожно малое количество хеликобактерпилори с целью прогнозирования заболевания, выявления возможной склонности к язвенной болезни, гастриту или раку желудка.

БИЛЕТ 7

1. Промикроскопируйте и опишите морфологические признаки бактерий, из предложенных препаратов (№ 1,2). Дайте характеристику различным морфологическим группам.

По внешнему виду бактерии делятся на три формы: палочковидные, шаровидные (кокки) и извитые (вибрионы и спириллы).

Кокковые формы различаются по форме деления и расположению в мазках. Они делятся в одной, двух, трех и более взаимно перпендикулярных плоскостях. При делении в одной плоскости они располагаются парами (диплококки) или цепочками (стрептококки); в двух плоскостях - по четыре (тетракокки), в трех плоскостях образуют пакеты (сарцины); при беспорядочном делении располагаются одиночно (микрококки) или в виде гроздьев винограда (стафилококки). Извитые формы имеют вид спирали. Микроорганизмы палочковидной формы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии.

К бактериям относятся палочковидные микроорганизмы, не образующие спор (кишечная палочка, сальмонеллы, возбудители туберкулеза и т.д.).

К бациллам и клостридиям (лат. closter - веретено) принадлежат микробы, образующие споры (сибиреязвенная, столбнячная палочки, возбудители анаэробной инфекции).

По форме палочковидные бактерии бывают короткими, длинными или средних размеров: с закругленными (большинство палочек), заостренными (фузобактерии), обрубленными (сибиреязвенная палочка) и булавовидными (коринебактерии) концами. Некоторые бактерии могут образовывать ветвления в виде боковых выростов (микобактерии туберкулеза).

По взаимному расположению палочковидные формы распределяются на три подгруппы:

диплобациллы и диплобактерии располагаются попарно; стрептобактерии и стрептобациллы - цепочками; беспорядочно расположенные бактерии и бациллы - в виде римских цифр II, V и т.д.

Извитые формы бактерий. К этой группе относятся вибрионы, спириллы и спирохеты.

Вибрионы - изгиб клетки равен 1/3-1/4 завитка спирали, имеющие вид запятой (холерный вибрион).

Спириллы имеют изгибы с одним или несколькими оборотами спирали.

Спирохеты имеют штопороподобную форму, размеры колеблются в больших пределах (ширина 0,3- 1,5 мкм и длина 7 - 500 мкм).

Палочковидные формы бактерий, подобно коккам, располагаются по длине парами - диплобактерии или цепочками - стрептобактерии. Палочковидные формы могут быть прямые и искривленные, строго цилиндрические и неравномерно утолщенные, с концами закругленными, заостренными или обрубленными.

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (предложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознавательных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристалл-виолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грам+). Например, спорообразующие бактерии родов - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам+ бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан-виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам- бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопротиидов и липополисахаридов. Грам- бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам+ отличаются от грам- не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам+ видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам-бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам+ в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

1. На одном предметном стекле готовят три мазка из бактериальных культур: заведомо известной Грамположительной, исследуемой и заведомо известной Грамотрицательной.

2. Мазки высушивают и фиксируют пламенем.

3. Окрашивают карболовым раствором генциан-виолета в течение 1-2 мин.

4. Краску удаляют стряхиванием, на мазки наносят раствор Люголя (раствор J и КJ) и выдерживают 1-2 мин. до почернения мазка.

5. Сливают раствор Люголя и на препарат наносят несколько капель 96% спирта и слегка покачивая стекло, выдерживают его до осветления мазка. (20-30 сек).

Препарат немедленно промывают водой. От обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработку все бактерии сохраняют окрашивание, при излишней – все клетки обесцвечиваются.

6. Дополнительно окрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный фуксин) в течение 2 мин.

7. Краску смывают, препарат подсушивают и смотрят с иммерсионным объективом 90х.

Если препарат приготовлен правильно, то в поле зрения видны грам + темно-фиолетовые клетки и рядом с ними хорошо различаются бледно-розовые грам- клетки.

ГРАМА МЕТОД (Н. Ch. J. Gram, датский врач, 1853-1938) - дифференциальная окраска бактерий; применяется для окраски бактерий в мазках из культур, экссудатов, тканей и пр. Метод предложен в 1884 г. и получил широкое распространение в бактериологии.

Сущность метода состоит в том, что при слабощелочной реакции бактерии окрашиваются основными красителями трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет). Обработка йодом или пикриновой к-той приводит к прочной фиксации красителя в определенных видах бактерий; последующее промывание окрашенного препарата нейтральным спиртом или ацетоном не обесцвечивает их (грамположительные бактерии). У других бактерий под влиянием йода не образуется прочного комплекса, и обработка спиртом или ацетоном приводит к обесцвечиванию. Эти бактерии (грамотрицательные) выявляются путем докрашивания контрастной краской. Грамположительность и грамотрицательность - важный диагностический признак в дифференциальной диагностике некоторых инфекционных заболеваний.

При окраске тканей по Г. м. клеточные структуры (за исключением хроматина делящихся ядер зернышек, базофильных клеток и рогового слоя эпидермиса) обесцвечиваются спиртом. Окраска по Граму вариабельна и зависит от многих факторов. Поэтому для получения точных и сравнимых результатов всегда следует придерживаться стандартной методики. Для фиксации препарата чаще используют высокую температуру, хотя могут быть применены и другие способы (см. Фиксация). Следует учитывать, что способ фиксирования влияет на ход окраски. Лучшими основными красителями для этого метода являются метилвиолет, генцианвиолет (см.) и др. Удовлетворительные результаты дают также основной фуксин, виктория синяя и др. В качестве протравы обычно применяют йод или пикриновую к-ту, но могут быть использованы бром, двухромовокислый калий, тринитрокрезол и др. Из обесцвечивающих агентов чаще применяют этиловый спирт и ацетон. Ацетон более активен в качестве средства, обесцвечивающего грамотрицательные бактерии. Используется также смесь из этих веществ.

Некоторые бактерии (Corynebacterium diphtheriae, Shigella dysenteriae, Вас. proteus) характеризуются грамнеустойчивостью, т. е. они находятся между безусловно грамположительными и безусловно грамотрицательными видами; отдельные клетки одного и того же вида также подвержены аналогичным колебаниям. Напр., в цепочке альфа-гемолитического стрептококка среди грамположительных кокков часто можно наблюдать грамотрицательную клетку. Особое влияние на окраску оказывает возраст культуры. Грампозитивность уменьшается с возрастом бактерии. Поэтому в старых культурах грамположительных видов обнаруживают большое количество грамотрицательных клеток. Мертвые и частично подвергшиеся аутолизу бактериальные клетки грамотрицательны. Результат окраски зависит от среды, в к-рой выращивается микроб. При оценке полученных данных, особенно в тех случаях, когда в грамотрицательных культурах обнаруживают грамположительные клетки, необходимо учитывать толщину мазка, влияющую на результат окраски. Желательно, чтобы толщина мазка была не больше толщины одной клетки, т. к. в толстом мазке, содержащем грамотрицательные микробы, часто наблюдаются грамположительные особи.

Техника окраски по Граму

Для окраски необходимо следующее: карболовый р-р красителя трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет или метилвиолет); р-р Люголя (2 г йодистого калия, 1 г йода кристаллического, 300 мл дистиллированной воды) щелочной или нейтральной реакции; спирт 96% нейтральной реакции; р-р контрастной краски (фуксин Пфейффера, 1% водный р-р нейтральрота и др.).

Мазок, фиксированный жаром, окрашивают генцианвиолетом или другим красителем 1-2 мин., промывают водой и наливают на препарат р-р Люголя (на 1 мин.), после чего дифференцируют спиртом 7 г - 1 мин. до появления серо-фиолетовых струек краски. Затем препарат промывают водой и докрашивают одной из контрастных красок. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, клетки и ткани - в красный. Предложены различные модификации метода Грама - А. И. Синева (применение генцианвиолетовой бумажки вместо карболового р-ра краски), Г. П. Калины, Хаккера (G. J. Hucker), Берк (V. Burke) и др.

Механизм окраски по Граму

Существует несколько теорий механизма окраски по Граму. Предполагалось, что грамположительная окраска обусловлена ненасыщенными жирными к-тами, имеющимися у некоторых бактерий и способными соединяться с йодом, в результате чего «эктоплазма» бактерий становится непроницаемой для спирта и извлечения адсорбированного красителя не происходит.

Другая теория [Стерн, Стерн (E. Stearn, A. Stearn), 1928] связывает механизм окраски по Граму с различиями в кислотно-основных свойствах протоплазмы у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Эти две группы бактерий характеризуются различной изоэлектрической точкой (см.), к-рая у грамположительных видов находится при pH 2,0-3,0, а у грамотрицательных ок. 5. Наряду с этим следует указать, что протравы, применяемые при окраске (йод, пикриновая к-та, бихромат и др.), являются окислителями и имеют тенденцию превращать некоторые комплексы протоплазмы в более кислые соединения, сдвигая изоэлектрическую точку бактерий в кислую сторону. Свойство йода и других протрав сдвигать изоэлектрическую точку в кислую сторону у грамположительных бактерий выражено в большей степени, чем у грамотрицательных, что указывает на определенные хим. различия между этими микробами. Поскольку сродство к красителям и резистентность к обесцвечиванию тем сильнее, чем ниже Изоэлектрическая точка бактерий, а исходное значение pH у грамположительных бактерий ниже, чем у грамотрицательных, и после обработки йодом оно в значительной степени еще снижается, создаются условия для прочной фиксации краски.

Химическая теория [Хенри, Стейси (Н. Henry, М. Stacey), 1943] объясняет грамположительность наличием на поверхности цитоплазмы клетки комплекса из белка и рибонуклеата магния. Этот комплекс можно экстрагировать из тела грамположительных бактерий желчными солями и превратить их в грамотрицательные. Полученный таким способом грамотрицательный вариант можно вновь превратить в грамположительные добавив к нему выделенный экстракт. Превращение грамположительных бактерий в грамотрицательные происходит также при обработке убитых бактерий рибонуклеазой. Присутствие протеин-рибонуклеата магния на поверхности клетки доказывается тем, что успех окраски зависит от структурной целостности бактерий. При механических повреждениях, разрыве оболочки, раздавливании, растирании можно наблюдать превращение поврежденных бактерий в грамотрицательные. Грамположительность сохраняется у морфологически целостных клеток.

Имеются данные, свидетельствующие, что в конечном итоге окраска по Граму зависит от разной проницаемости клеточных стенок у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В частности, указывается, что клеточная стенка грамположительных бактерий содержит больше пептидогликана, чем грамотрицательных бактерий, и, что особенно важно, пептидогликаны обеих групп бактерий структурно отличаются друг от друга. В пептидогликане грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus) остатки N-ацетил мурамовой к-ты содержат О-ацетилгруппы в положении C6, что придает молекулам пептидогликана устойчивость, в частности к лизоциму. Высказывается предположение, что обработка спиртом при окраске по Граму уменьшает диаметр пор в пецтидогликановом слое у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

В силу этого комплекс генцианвиолет - йод при обработке спиртом удерживаемся грамположительной клеткой и извлекается из грамотрицательной.

Библиография: Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Роуз Э. Химическая микробиология, пер. с англ., М., 1971; .Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 23, М., 1973; The bacteria, ed. by I. С. Gunsalus a. R. J. Sta-nier, y. 1, N. Y. - L., 1960; G r a m H. C.J. tiber die isolierte Farbung der Schizomy-ceten in Schnitt-und Trockenpraparaten, Fortschr. Med., Bd 2, S. 185, 1884.

Д. М. Гольдфарб.