Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Изменение условий внешней среды оказывает воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Физические, химические, биологические факторы среды могут ускорять или подавлять развитие микробов, могут изменять их свойства или даже вызывать гибель.

К факторам среды, оказывающим наиболее заметное действие на , относятся влажность, температура, кислотность и химический состав среды, действие света и других физических факторов.

Влажность

Микроорганизмы могут жить и развиваться только в среде с определенным содержанием влаги. Вода необходима для всех процессов обмена веществ микроорганизмов, для нормального осмотического давления в микробной клетке, для сохранения ее жизнеспособности. У различных микроорганизмов потребность в воде не одинакова. Бактерии относятся в основном к влаголюбивым, при влажности среды ниже 20 % их рост прекращается. Для плесеней нижний предел влажности среды составляет 15%, а при значительной влажности воздуха и ниже. Оседание водяных паров из воздуха на поверхность продукта способствует размножению микроорганизмов.

При снижении содержания воды в среде рост микроорганизмов замедляется и может совсем прекращаться. Поэтому сухие продукты могут храниться значительно дольше продуктов с высокой влажностью. Сушка продуктов позволяет сохранять продукты при комнатной температуре без охлаждения.

Некоторые микробы очень устойчивы к высушиванию, некоторые бактерии и дрожжи в высушенном состоянии могут сохраняться до месяца и более. Споры бактерий и плесневых грибов сохраняют жизнеспособность при отсутствии влаги десятки, а иногда и сотни лет.

Температура

Температура — важнейший фактор для развития микроорганизмов. Для каждого из микроорганизмов существует минимум, оптимум и максимум температурного режима для роста. По этому свойству микробы подразделяются на три группы:

• психрофилы - микроорганизмы, хорошо растущие при низких температурах с минимумом при -10-0 °С, оптимумом при 10-15 °С;
• мезофилы - микроорганизмы, для которых оптимум роста наблюдается при 25-35 °С, минимум — при 5-10 °С, максимум — при 50-60 °С;
• термофилы - микроорганизмы, хорошо растущие при относительно высоких температурах с оптимумом роста при 50-65 °С, максимумом — при температуре более 70 °С.

Большинство микроорганизмов относится к мезофилам, для развития которых оптимальной является температура 25-35 °С. Поэтому хранение пищевых продуктов при такой температуре приводит к быстрому размножению в них микроорганизмов и порче продуктов. Некоторые микробы при значительном накоплении в продуктах способны привести к пищевым отравлениям человека. Патогенные микроорганизмы, т.е. вызывающие инфекционные заболевания человека, также относятся к мезофилам.

Низкие температуры замедляют рост микроорганизмов, но не убивают их. В охлажденных пищевых продуктах рост микроорганизмов замедленно, но продолжается. При температуре ниже О °С большинство микробов прекращают размножаться, т.е. при замораживании продуктов рост микробов останавливается, некоторые из них постепенно отмирают. Установлено, что при температуре ниже О °С большинство микроорганизмов впадают в состояние, похожее на анабиоз, сохраняют свою жизнеспособность и при повышении температуры продолжают свое развитие. Это свойство микроорганизмов следует учитывать при хранении и дальнейшей кулинарной обработке пищевых продуктов. Например, в замороженном мясе могут длительно сохраняться сальмонеллы, а после размораживания мяса они в благоприятных условиях быстро накапливаются до опасного для человека количества.

При воздействии высокой температуры, превышающей максимум выносливости микроорганизмов, происходит их отмирание. Бактерии, не обладающие способностью образовывать споры, погибают при нагревании во влажной среде до 60-70 °С через 15-30 мин, до 80-100 °С — через несколько секунд или минут. У спор бактерий термоустойчивость значительно выше. Они способны выдерживать 100 °С в течение 1-6 ч, при температуре 120-130 °С споры бактерий во влажной среде погибают через 20-30 мин. Споры плесеней менее термостойки.

Тепловая кулинарная обработка пищевых продуктов в общественном питании, пастеризация и стерилизация продуктов в пищевой промышленности приводят к частичной или полной (стерилизация) гибели вегетативных клеток микроорганизмов.

При пастеризации пищевой продукт подвергается минимальному температурному воздействию. В зависимости от температурного режима различают низкую и высокую пастеризацию.

Низкая пастеризация проводится при температуре, не превышающей 65-80 °С, не менее 20 мин для большей гарантии безопасности продукта.

Высокая пастеризация представляет собой кратковременное (не более 1 мин) воздействие на пастеризуемый продукт температуры выше 90 °С, которая приводит к гибели патогенной неспороносной микрофлоры и в то же время не влечет за собой существенных изменений природных свойств пастеризуемых продуктов. Пастеризованные продукты не могут храниться без холода.

Стерилизация предусматривает освобождение продукта от всех форм микроорганизмов, в том числе и спор. Стерилизация баночных консервов проводится в специальных устройствах — автоклавах (под давлением пара) при температуре 110-125°С в течение 20-60 мин. Стерилизация обеспечивает возможность длительного хранения консервов. Молоко стерилизуется метолом ультравысокотемпературной обработки (при температуре выше 130 °С) в течение нескольких секунд, что позволяет сохранить все полезные свойства молока.

Реакция среды

Жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации водородных (Н +) или гидроксильных (ОН -) ионов в субстрате, на котором они развиваются. Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная (рН около 7) или слабощелочная среда. Плесневые грибы и дрожжи хорошо растут при слабокислой реакции среды. Высокая кислотность среды (рН ниже 4,0) препятствует развитию бактерий, однако плесени могут продолжать расти и в более кислой среде. Подавление роста гнилостных микроорганизмов при подкислении среды имеет практическое применение. Добавление уксусной кислоты используется при мариновании продуктов, что препятствует процессам гниения и позволяет сохранить продукты. Образующаяся при квашении молочная кислота также подавляет рост гнилостных бактерий.

Концентрация соли и сахара

Поваренная соль и сахар издавна используются для повышения стойкости продуктов к микробной порче и лучшей сохранности пищевых продуктов.

Некоторые микроорганизмы нуждаются для своего развития в высоких концентрациях соли (20 % и выше). Их называют солелюбивыми, или галофилами. Они могут вызывать порчу соленых продуктов.

Высокие концентрации сахара (выше 55-65 %) прекращают размножение большинства микроорганизмов, это используется при приготовлении из плодов и ягод варенья, джема или повидла. Однако эти продукты тоже могут подвергаться порче в результате размножения осмофильных плесеней или дрожжей.

Свет

Некоторым микроорганизмам свет необходим для нормального развития, но для большинства из них он губителен. Ультрафиолетовые лучи солнца обладают бактерицидным действием, т. е. при определенных дозах облучения приводят к гибели микроорганизмов. Бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей ртутно-кварцевых ламп используют для дезинфекции воздуха, воды, некоторых пищевых продуктов. Инфракрасные лучи тоже могут вызвать гибель микробов за счет теплового воздействия. Воздействие этих лучей применяют при тепловой обработке продуктов. Негативное воздействие на микроорганизмы могут оказывать электромагнитные поля, ионизирующие излучения и другие физические факторы среды.

Химические факторы

Некоторые химические вещества способны оказывать на микроорганизмы губительное действие. Химические вещества, обладающие бактерицидным действием, называют антисептиками. К ним относятся дезинфицирующие средства (хлорная известь, гипохлориты и др.), используемые в медицине, на предприятиях пищевой промышленности и общественного питания.

Некоторые антисептики применяются в качестве пищевых добавок (сорбиновая и бензойная кислоты и др.) при изготовлении соков, икры, кремов, салатов и других продуктов.

Биологические факторы

Антагонистические свойства некоторых объясняются способностью их выделять в окружающую среду вещества, обладающие антимикробным (бактериостатическим, бактерицидным или фунгицидным) действием, - антибиотики. Антибиотики продуцируются в основном грибами, реже бактериями, они оказывают свое специфическое действие на определенные виды бактерий или грибов (фунгицидное действие). Антибиотики применяются в медицине (пенициллин, левомицетин, стрептомицин и др.), в животноводстве в качестве кормовой добавки, в пищевой промышленности для консервирования пищевых продуктов (низин).

Антибиотическими свойствами обладают фитонциды — вещества, обнаруженные во многих растениях и пищевых продуктах (лук, чеснок, редька, хрен, пряности и др.). К фитонцидам относятся эфирные масла, антоцианы и другие вещества. Они способны вызывать гибель патогенных микроорганизмов и гнилостных бактерий.

В яичном белке, рыбной икре, слезах, слюне содержится лизоцим — антибиотическое вещество животного происхождения.

Физические, химические и биологические факторы окружающей среды оказывают раз­личное воздействие на микроорганизмы: бак­терицидное - приводящее к гибели клетки; бактериостатическое - подавляющее размно­жение микроорганизмов; мутагенное - изме­няющее наследственные свойства микробов.

4.3.1. Влияние физических факторов

Влияние температуры. Представители различ­ных групп микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии,

растущие при низкой температуре, называют психрофилами; при средней (около 37 °С) - ме­зофитами; при высокой - термофилами.

Психрофильные микроорганизмы растут при температуре от -10 до 40 "С; температурный оп­тимум колеблется от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бакте­рий. К психрофилам относится большая группа сапрофитов - обитателей почвы, морей, пре­сных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые психрофилы могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера­туре 4 "С, а возбудитель чумы - в диапазоне от 0 до 40 °С при оптимуме роста 25 °С). В зависи­мости от температуры культивирования свойс­тва бактерий меняются. Так, Serratia marcescens образует при температуре 20-25 °С большее ко­личество красного пигмента (продигиозана), чем при температуре 37 °С. Возбудитель чумы, выращенный при 25 °С, вирулентнее, чем при 37 "С. Синтез полисахаридов, в том числе кап-сульных, активизируется при более низких тем­пературах культивирования.

Мезофилы растут в диапазоне температур от 10 до 47 °С, оптимум роста около 37 "С. Они включают в себя основную группу патоген­ных и условно-патогенных бактерий.

Термофильные бактерии развиваются при бо­лее высоких температурах (от 40 до 90 °С). На дне океана в горячих сульфидных водах жи­вут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 265 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности на­возом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как по­казатель загрязненности почвы.

Температурный фактор учитывается при осу­ществлении стерилизации. Вегетативные фор­мы бактерий погибают при температуре 60 °С в течение 20-30 мин., споры - в автоклаве при 120 °С в условиях пара под давлением.

Микроорганизмы хорошо переносят дейс­твие низких температур. Поэтому их можно

долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого азота (-173 °С).

Высушивание. Обезвоживание вызывает на­рушение функций большинства микроорга­низмов. Наиболее чувствительны к высушива­нию возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и другие пато­генные микроорганизмы. Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные сли­зью мокроты. Так, бактерии туберкулеза в мок­роте выдерживают высушивание до 90 дней. Устойчивы к высушиванию некоторые кап-суло- и слизеобразующие бактерии. Особой устойчивостью обладают споры бактерий. Например, споры возбудителя сибирской язвы могут сохраняться в почве столетиями.

Для продления жизнеспособности, при консервировании микроорганизмов, ис­пользуют лиофилизацию - высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные культуры микроорга­низмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохра­няются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения. Ионизирующее излу­чение применяют для стерилизации одно­разовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных ма­териалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучении, напри­мер Micrococcus radiodurans был выделен из ядерного реактора.

Неионизирующее излучение - ультрафи­олетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно дейс­твуют на микроорганизмы уже через корот­кий промежуток времени.

Ультрафиолетовые лучи, достигающие по­верхности земли, имеют длину волны 290 нм. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабо­раториях. С этой целью используют бактери­цидные лампы ультрафиолетового излучения с длиной волны 200-400 нм.

4.3.2. Влияние химических веществ

Химические вещества могут оказывать раз­личное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост, вызывать гибель. Антимикробные хими­ческие вещества используются в качестве ан­тисептических и дезинфицирующих средств, так как обладают бактерицидным, вирули-цидным, фунгицидным действием и т. д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным груп­пам, среди которых наиболее широко пред­ставлены хлор-, йод- и бромсодержащие со­единения и окислители (см. разд. 7.7).

4.3.3. Влияние биологических факторов
Микроорганизмы находятся в различ­
ных взаимоотношениях друг с другом.
Совместное существование двух различных
организмов называется симбиозом (от греч.
simbiosis - совместная жизнь). Различают
несколько вариантов полезных взаимоотно­
шений: метабиоз, мутуализм, комменсализм,
сателлизм.

Метабиоз - взаимоотношение микроор­ганизмов, при котором один из них исполь­зует для своей жизнедеятельности продукты жизнедеятельности другого. Метабиоз ха­рактерен для почвенных нитрифицирую­щих бактерий, использующих для своего метаболизма аммиак - продукт жизнеде­ятельности аммонифицирующих почвен­ных бактерий.

Мутуализм - взаимовыгодные взаимо­отношения разных организмов. Примером мутуалистического симбиоза являются ли­шайники - симбиоз гриба и сине-зеленой водоросли. Получая от клеток водоросли ор­ганические вещества, гриб, в свою очередь, поставляет им минеральные соли и защищает от высыхания.

Комменсализм (от лат. commensalis - со­трапезник) - сожительство особей разных видов, при котором выгоду из симбиоза извлекает один вид, не причиняя другому вреда. Комменсалами являются бактерии - представители нормальной микрофлоры че­ловека

Сателлизм - усиление роста одного ви­да микроорганизма под влиянием другого вида микроорганизма. Например, колонии дрожжей или сарцин, выделяя в питательную среду метаболиты, стимулируют рост вокруг них колоний других микроорганизмов. При совместном росте нескольких видов мик­роорганизмов могут активизироваться их физиологические функции и свойства, что приводит к более быстрому воздействию на субстрат.

Антагонистические взаимоотношения, или антагонистический симбиоз, выражаются в виде неблагоприятного воздействия одного вида микроорганизма на другой, приводяще­го к повреждению и даже гибели последнего. Микроорганизмы-антагонисты распростра­нены в почве, воде и в организме человека и животных. Хорошо известна антагонистичес­кая активность против посторонней и гни­лостной микрофлоры представителей нор­мальной микрофлоры толстого кишечника человека - бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки и др.

Механизм антагонистических взаимоотно­шений разнообразен. Распространенной фор­мой антагонизма является образование анти­биотиков - специфических продуктов обме­на микроорганизмов, подавляющих развитие микроорганизмов других видов. Существуют и другие проявления антагонизма, например большая скорость размножения, продукция бактериоцинов, в частности колицинов, про­дукция органических кислот и других продук­тов, изменяющих рН среды.

Микроорганизмы встречаются в самых неподходящих, на наш взгляд, экологических нишах. Так, некоторые виды бактерий (Bacillus submarinus) способны жить в океанах на глубине более 5000 м, выдерживая гидростатическое давление свыше 3,1–10 8 Па, экстремально термофильные бактерии Thermus aquaticus выделяются из воды и илов горячих источников, температура которых достигает 92° С, крайние галофильные бактерии обнаружены в воде Мертвого моря.

Определенные факторы среды могут различно влиять на микроорганизмы, действовать на них угнетающе либо вызывать гибель микробной популяции. Положительный или отрицательный эффект действующего фактора обусловлен как природой самого фактора, так и свойствами микроорганизма.

Влажность. Наличие влаги обусловливает уровень процессов метаболизма в клетке, поступление в нее веществ питательного субстрата, энергию роста и размножения бактерий.

Большинство бактерий при влажности среды свыше 20% развиваются нормально.

Высушивание бактерий приводит к обезвоживанию цитоплазмы клетки, почти полному прекращению процессов метаболизма и в конечном итоге к переходу микробной клетки в состояние анабиоза. Использование высушивания применяется при хранении пищевых продуктов.

Часто и в условиях глубокого иссушения бактерии сохраняют жизнеспособность. Так, микобактерии туберкулеза сохраняют жизнеспособность в высохшей мокроте больного более 10 месяцев, споры бацилл сибирской язвы в сухом состоянии выживают до 10 лет. Метод сублимаций (высушивания) в настоящее время широко применяется для длительного хранения живых вакцин против туберкулеза, чумы, оспы, гриппа, а также для содержания производственных и музейных культур микроорганизмов.

Температура. Жизнедеятельность прокариот непосредственно зависит от температурного диапазона. Он характеризуется тремя кардинальными точками: минимальная температура, ниже которой прекращается рост и развитие бактерий; оптимальная температура, соответствующая наивысшей скорости роста микроба, максимальная температура, выше которой скорость роста бактерий практически снижается до нуля. На основании температурного диапазона все прокариоты подразделяются на 3 группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы (от греч. psychros – холод, phileo – люблю) представлены бактериями, развивающимися при низких температурах от – 5 до 20–35 0 С. Среди них выделяют подгруппу облигатных психрофилов, неспособных расти при температуре выше 20 °С. Это бактерии глубоких озер, северных морей и океанов. Вторую весьма обширную подгруппу составляют факультативные психрофилы – бактерии, приспособившиеся к действию переменных температур от – 5 °С до 20–35 °С, населяют зону умеренного климата.

Низкие температуры замедляют в клетке процессы метаболизма, на этом основано использование холодильников, погребов и ледников для хранения пищевых продуктов. Многие микроорганизмы в толще природных льдов способны пребывать в состоянии анабиоза «захороненными» до 12000 лет.

К мезофилам (от греч. mesos – средний) относится подавляющая масса прокариот, для которых температурный диапазон лежит в пределах 10–47° С, при оптимальных температурах 30–40° С. В эту группу входят многие патогенные бактерии, вызывающие заболевания теплокровных животных и человека.

Термофилы (от греч. thermos – тепло, жар) составляют разнообразную группу бактерий, растущих в температурном диапазоне от 10 до 55–60° С. Факультативные термофилы, одинаково успешно развиваются как при температуре 55–60° С, так и при 10–20° С, и облигатные термофилы, не способные к росту при температуре ниже 40° С. Экстремальные термофилы живут при температуре выше 70° С. Они выделены из горячих источников и отнесены к родам Thermomicrobium, Thermus, Thermothrix и др. Особую стойкость к высокой температуре проявляют споры бактерий, выдерживающие температуру кипения в течение двух-трех часов.

Лучистая энергия . Различные виды излучений по разному влияют на бактерии. Инфракрасное излучение (длины волн от 760 нм до 400 мкм) не способно вызвать какие-либо существенные фотохимические изменения в живых клетках. Рентгеновские лучи (длины волн менее 10 нм) ионизируют макромолекулы живых клеток. Возникающие фотохимические изменения вызывают развитие мутаций либо гибель клетки. Отдельные виды бактерий обладают поразительной устойчивостью к действию рентгеновских лучей. Это тионовые бактерии, обитающие в залежах урановых руд, а также бактерии Micrococcus radiodurans, выделяемые из воды атомных реакторов при дозе ионизирующего излучения в 2–3 млн. рад.

Видимый свет (длины волн от 380 до 760 нм) оказывает благоприятное влияние только на развитие фотосинтезирующих бактерий.

Сильным эффектом обладают ультрафиолетовые лучи с длиной волны 253,7 нм. На бактерицидном действии ультрафиолетовых лучей на бактерии основано использование их для обеззараживания продуктов питания, питательных сред, посуды, а также дезинфекции палат, операционных, помещений родильных домов.

Ультразвук. Ультразвук – высокочастотные колебания звуковых волн (более 20000 Гц). Ультразвук оказывает мощное бактерицидное действие на прокариоты. Сила этого действия зависит от частоты колебаний, длительности воздействия, а также от физиологического состояния и индивидуальных особенностей микроорганизма. При длительном озвучивании микробной культуры наблюдается 100%-ный летальный эффект.

Действие ультразвука заключается в необратимых физико-химических изменениях компонентов микробной клетки и механических повреждениях всех клеточных структур. В настоящее время ультразвук применяют для стерилизации пищевых продуктов, лабораторного оборудования и вакцин.

Реакция среды. Реакция среды является одним из важных факторов, определяющих развитие бактерий, влияет на растворимость веществ питательного субстрата и поступление их в клетку. Изменение реакции среды нередко сопровождается повышением концентрации токсических соединений.

Прокариоты по отношению их к кислотности среды могут быть разделены на несколько групп. Подавляющее большинство их относятся к нейтрофилам, для которых оптимальна нейтральная среда. В этой группы многие бактерии способны проявлять кислотоустойчивость или щелочеустойчиость.

Среди прокариот имеются ацидофилы, развивающиеся в кислой среде со значением рН 2–3. К умеренным ацидофилам относятся бактерии, обитающие в воде кислых болот и озер, а также в кислых почвах при
рН 3–4. Крайними ацидофилами являются бактерии родов Thiobacillus и Sulfomonas, а также Thermoplasma acidophila.

Алкалофильные бактерии сушествуют в щелочной среде. К алкалофильным бактериям относятся представители рода Bacillus и холерный вибрион, размножение которого возрастает при значении рН выше 9.

На отрицательном влиянии повышенной кислотности среды на большинство микроорганизмов основано применение маринадов.

Кислород. Большинство прокариот для жизнедеятельности нуждаются в кислороде и носят название облигатных (строгих) аэробов.

Облигатные аэробы способны выдерживать концентрацию кислорода порядка 40–50%. Бактерии, для которых молекулярный кислород необходим в незначительных количествах – не более 2%, получили название микроаэрофилов.

Вторую группу прокариот составляют микроорганизмы, для жизнедеятельности которых молекулярный кислород не нужен. Такие микроорганизмы получили название облигатных анаэробов. К ним относятся маслянокислые, метанобразующие, сульфатвосстанавливающие и некоторые другие бактерии. В клетках облигатных анаэробов окисление веществ субстрата происходит без участиякислорода. К ним относятся представители родов Methanobacterium, Methanosarcina, Fusobacterium и др.

Многие виды маслянокислых бактерий проявляют устойчивость к молекулярному кислороду и носят название аэротолерантных. Примером аэротолерантов являются бактерии рода Clostridium. Особую аэротолерантность проявляют эндоспоры маслянокислых бактерий. Прокариоты, способные расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях и переключать свой энергетический метаболизм с одного способа получения энергии на другой, получили название факультативных аэробов или факультативных анаэробов. Примером факультативных анаэробов являются денитрифицирующие и десульфофицирующие бактерии, а также обширная группа энтеробактерий.

Антисептики. Химические соединения, оказывающие губительное действие на микроорганизмы, получили название антисептиков.

Действие антисептика на бактерии может быть бактериостатическим или бактерицидным. Бактериостатическое действие лишь прекращает рост и размножение микробных клеток; бактерицидное – вызывает гибель бактерий, что нередко сопровождается лизисом клеток. Получаемый эффект зависит от самой природы химических соединений, их концентрации, от продолжительности действия антисептика на микроорганизмы, а также от сопутствующих факторов среды – температуры, величины рН и т.д.

Антисептики представлены различными органическими и неорганическими соединениями. Из неорганических соединений сильными антисептиками являются соли тяжелых металлов – ртути (сулема), свинца, серебра, цинка и др. Соли ртути, серебра, мышьяка проявляют сильное ингибирующее действие на ферменты микробной клетки. Даже в незначительных концентрациях 1:1000 соли тяжелых металлов вызывают гибель большинства бактерий в течение нескольких минут.

Из органических соединений антисептическим действием обладают этиловый и изопропиловый спирты (70%-ные растворы), фенол, крезол и их производные, формальдегид. Особенно широкое применение находит фенол (карболовая кислота). Большинство микробов погибают от действия 1–5%-ного раствора карболовой кислоты. Сильным антисептиком является формальдегид.

Влияние физических факторов .

Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) - мезофилами, при высокой - термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов - обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум - от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.

Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 262 атм.

Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.

Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (-173 °С).

Высушивание . Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния - лиофилизацию - используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения . Неионизирующее излучение - ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200-450 нм.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.

Действие химических веществ . Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.

Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).

Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.

Дезинфекция - процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.

Дисбиозы. Препараты для восстановления микробиоты. Состояние эубиоза - динамического равновесия нормальной микрофлоры и организма человека - может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой терапии и химиотерапии, нерационального питания, оперативных вмешательств и т. д. В результате нарушается колонизационная резистентность. Аномально размножившиеся транзиторные микроорганизмы продуцируют токсичные продукты метаболизма - индол, скатол, аммиак, сероводород.

Состояния, развивающиеся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называются дисбактериозом и дисбиозом .

При дисбактериозе происходят стойкие количественные и качественные изменения бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. При дисбиозе изменения происходят и среди других групп микроорганизмов (виру­сов, грибов и др.). Дисбиоз и дисбактериоз могут приводить к эндогенным инфекция­м.

Дисбиозы классифицируют по этиологии (грибковый, стафилококковый, протейный и др.) и по локализации (дисбиоз рта, кишки, влагалища и т. д.). Изменения в составе и функциях нормальной микрофлоры сопровождаются различными нарушениями: разви­тием инфекций, диарей, запоров, синдрома мальабсорбции, гастритов, колитов, язвенной болезни, злокачественных новообразований, аллергий, мочекаменной болезни, гипо- и гиперхолестеринемии, гипо- и гипертензии, кариеса, артрита, поражений печени и др.

Нарушения нормальной микрофлоры человека определяются следующим образом:

1. Выявление видового и количественного состава представителей микробиоценоза определенного биотопа (кишки, рта, влагалища, кожи и т. д.) - путем высева из разведений исследуемого материала или путем отпечатков, смыва на соответствующие питательные среды (среда Блаурокка - для бифидобактерий; среда МРС-2 - для лактобактерий; анаэробный кровяной агар - для бактероидов; среда Левина или Эндо - для энтеробактерий; желчно-кровяной агар - для энтерококков; кровяной агар - для стрептококков и гемофилов; мясопептонный агар с фурагином - для синегнойной палочки, среда Сабуро - для грибов и др.).

2. Определение в исследуемом материале микробных метаболитов - маркеров дисбиоза (жирных кислот, гидроксижирных кислот, жирнокислотных альдегидов, ферментов и др.). Например, обнаружение в фекалиях бета-аспартилглицина и бета-аспартиллизина свидетельствует о нарушении кишечного микробиоценоза, так как в норме эти дипептиды метаболизируются кишечной анаэробной микрофлорой.

Для восстановления нормальной микрофлоры: а) проводят селективную деконтаминацию; б) назначают препараты пробиотиков (эубиотиков), полученные из лиофильно высушенных живых бактерий - представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерий (бифидумбактерин), кишечной палочки (колибактерин), лактобактерий (лактобактерин) и др.

Пробиотики - препараты, оказывающие при приемеper os нормализирующее действие на организм человека и его микрофлору.

Пребиотики – различные вещества, которые служат для питания представителей норм. Микробиоты и и улучшения моторики кишечника. Эубиотики – культуры м/о, относяиеся к представителям нормальной микробиоты кишечника. Например – лактобактерин, витофлор, линекс.

Иммерсионный микроскоп. Иммерсионная микроскопия (отлат. immersio - погружение) - методмикроскопического исследования малых объектов с помощью погруженияобъектива светового микроскопа в среду с высокимкоэффициентом преломления , расположенную междумикроскопическим препаратом и объективом.

Для проведения исследований используют специальные иммерсионные объективы (объективы для масляной иммерсии имеют чёрную полосу на оправе, вблизи от фронтальной линзы; объективы для водной иммерсии - белую полосу ).

Жидкостная иммерсия

Для иммерсионной микроскопии применялись различные жидкости. Наибольшее распространение нашли кедровое масло (показатель преломления n=1,515), глицерин (n=1,4739) и вода (дистиллированная , n=1,3329). Физиологический раствор имеет n=1,3346.

Водная иммерсия. На практике «водная иммерсия» широко применялась ещё до изобретения самого понятия иммерсия , когда объектив микроскопа , для наблюдения за обитателями прудов или луж, полностью погружали в воду. Это позволяет увеличить разрешающую способность объектива и микроскопической системы в целом.

Для исследований в световой микроскопии широко применяются специальные объективы для водной иммерсии , имеющие повышенную числовую апертуру , за счёт того, что показатель преломления воды выше, чем у воздуха.

Масляная иммерсия. Традиционно в качестве среды для масляной иммерсии применяется кедровое масло. Однако оно имеет существенный недостаток: по мере постепенного окисления на воздухе, оно густеет, желтеет и постепенно превращается в слишком вязкую тёмную жидкость.

11.История микробиологии. Этапы. Задачи. Историю развития микробиологии можно разделить на пять этапов: эвристический, морфологический, физиологический, иммунологический и молекулярно-генетический.

Пастер сделал ряд выдающихся открытий. За короткий период с 1857 по 1885 г. он доказал, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое) не является химическим процессом, а его вызывают микроорганизмы; опроверг теорию самозарождения; открыл явление анаэробиоза, т.е. возможность жизни микроорганизмов в отсутствие кислорода; заложил основы дезинфекции, асептики и антисептики; открыл способ предохранения от инфекционных болезней с помощью вакцинации.

Многие открытия Л. Пастера принесли человечеству огромную практическую пользу. Путем прогревания (пастеризации) были побеждены болезни пива и вина, молочнокислых продук­тов, вызываемые микроорганизмами; для предупреждения гнойных осложнений ран введена антисептика; на основе принципов Л. Пастера разработаны многие вакцины для борьбы с инфекционными болезнями.

Однако значение трудов Л. Пастера выходит далеко за рамки только этих практических достижений. Л. Пастер вывел микробиологию и иммунологию на принципиально новые позиции, показал роль микроорганизмов в жизни людей, экономике, промышленности, инфекционной патологии, заложил принципы, по которым развиваются микробиология и иммунология и в наше время.

Л. Пастер был, кроме того, выдающимся учителем и организатором науки.

Работы Л. Пастера по вакцинации открыли новый этап в развитии микробиологии, по праву получивший название иммунологического.

Принцип аттенуации (ослабления) микроорганизмов с помощью пассажей через восприимчивое животное или при выдерживании микроорганизмов в неблагоприятных условиях (температура, высушивание) позволил Л. Пастеру получить вакцины против бешенства, сибирской язвы, куриной холеры; этот принцип до настоящего времени используется при приготовлении вакцин. Следовательно, Л. Пастер является основоположником научной иммунологии, хотя и до него был известен метод предупреждения оспы путем заражения людей коровьей оспой, разработанный английским врачом Э. Дженнером. Однако этот метод не был распространен на профилактику других болезней.

Роберт Кох . Физиологический период в развитии микробиологии связан также с именем немецкого ученого Роберта Коха, которому при­надлежит разработка методов получения чистых культур бактерий, окраски бактерий при микроскопии, микрофотографии. Известна также сформулированная Р. Кохом триада Коха, которой до сих пор пользуются при установлении возбудителя болезни.

Задачи. - изучение биологических свойств болезнетворных организмов - разработка методов диагностики вызываемых видов заболеваний - разработка методов борьбы болезнетворными м/о - создание методов стимуляции м/о, полезных для человека

Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.

Клеточная стенка . В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка).

В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.

Функции клеточной стенки :

Обусловливает форму клетки.

Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.

Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.

Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.

Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.

L-формы бактерий, их медицинское значение L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению.

14.Методы культивирования вирусов. Вирусологический метод. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий - облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты - реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод - реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток . Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6-7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек .

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям , которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8-12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки - к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования. Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы. Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Источник получения клеток - ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека или почечных клеток обезьян. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной. 15. Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция - свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция - люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Люминесцентный метод микроскопии занимает важное место в исследовании микроорганизмов. Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии. Только немногие бактерии (люминесцирующие) способны светиться собственным светом в результате интенсивных процессов окисления, протекающих у них со значительным выделением энергии.

Большинство микроорганизмов приобретает способность люминесцировать, или флюоресцировать, при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски специальными красителями - флюорохромами. Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще используют красители- флюорохромы: акридин оранжевый, аурамин, корифосфин, флюоресцеин в виде очень слабых водных растворов.

При окраске корифосфином коринебактерии дифтерии дают желто-зеленое свечение в ультрафиолетовом свете, микобактерии туберкулеза при окраске аурамин-родамином - золотисто-оранжевое. Для успешной микроскопии необходим яркий источник света, в качестве которого используют ртутно-кварцевую лампу высокого давления. Между источником света и зеркалом помещают сине-фиолетовый светофильтр, который пропускает только короткие и средние волны ультрафиолетового света. Попав на объектив, эти волны возбуждают в нем люминесценцию. Чтобы увидеть ее, на окуляр микроскопа надевают желтый фильтр, который пропускает длинноволновый свет флюоресценции, возникающий при прохождении лучей через объект. Короткие волны, не поглощенные исследуемым объектом, убираются, отсекаются этим фильтром.

Существуют специальные люминесцирующие микроскопы МЛ-1, МЛ-2, MЛ-3, а также простые устройства: комплект ОИ-17 (опакиллюминатор), ОИ-18 (осветительное устройство с ртутно-кварцевой лампой СВД-120А), дающие возможность применять для люминесцентной микроскопии обычный биологический микроскоп.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. Исследование микроорганизмов в темном поле (темнопольная микроскопия) основано на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами (параболоид- или кардиоид-конденсор), который создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом. Поэтому на темном фоне препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в.темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно темнопольную микроскопию используют при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спирохеты. Для создания темного поля можно также использовать обычный конденсор Аббе, поместив в центр его кружок черной бумаги. В этом случае свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют конденсор Аббе. Препарат для микроскопии готовят по методу раздавленной капли. Толщина предметного стекла не должна превышать 1 - 1,1 мм, иначе фокус конденсора придется в толщу стекла. Между конденсором и предметным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. При правильной установке освещения на темном поле видны яркие светящиеся точки.

Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным - светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. Глаз человека может улавливать изменения длины волны и интенсивности видимого света только при исследовании непрозрачных объектов, проходя через которые, световые волны равномерно или неравномерно ослабляются, т. е. меняют величину амплитуды. Такие объекты называются амплитудными. Обычно это фиксированные и окрашенные препараты микроорганизмов или срезы тканей. Живые клетки вследствие высокого содержания в них воды слабо поглощают свет, поэтому почти все компоненты их прозрачны.

Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее способны изменять фазу проходящих через них лучей (фазовые объекты). В разных участках клеток, отличающихся показателем преломления и толщиной, изменение фаз будет неодинаковым. Эти разности фаз, возникающие при прохождении видимого света через живые объекты, можно сделать видимыми с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Фазово-контрастная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа и специального приспособления, куда входят фазово-контрастный конденсор с кольцевыми диафрагмами и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Для первоначальной наводки используют вспомогательный микроскоп, с помощью которого добиваются того, чтобы через кольцевую диафрагму конденсора в объектив проникало лишь кольцо света. Луч света, пройдя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и дифрагированный (преломленный). Прямой луч, проникнув через частицу, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а дифрагированный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Поэтому оптические пути их различны и между ними создается разность фаз. Она сильно увеличивается с помощью фазовой пластинки и благодаря этому контрастность изображения повышается, что позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

16. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам(антибиотикограммы) обычно применяют:

Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков).Метод дисков - качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Этоколичественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.К умеренно устойчивым относятся штаммы , для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы , рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).

Солнечное излучение, проходящее через верхние слои атмосферы и достигающее поверхности Земли состоит из электромагнитных волн с длиной 300-10.000 нм.

75 % падающего на Землю света - это видимая часть спектра – охватывает диапазон 390-760 нм . Эта часть воспринимается человеческим взглядом.

20 % - инфракрасное излучение (ближнее) с λ волн от 790 нм и далее (790-1100).

5 % - УФ с λ волн 300-380 нм.

Озоновый слой поглощает волны с длиной 220-300 нм .

Влияние видимого света на микроорганизмы

Видимый свет используется фотосинтезирующими микроорганизмами. Спектральный состав ФАР различен для разных групп микроорганизмов и зависит от набора пигментов. Оксигенный фотосинтез (цианобактерии, прохлорофиты) возможен в диапазоне от 300 до 750 нм. У этих бактерий хлорофилл а и b , с максимумом поглощения 680-685 и 650-660 нм, соответственно. У цианобактерий фикобилипротеиды (красные и синие пигменты) поглощают свет с длиной 450-700 нм.

Аноксигенный фотосинтез (пурпурные, зеленые бактерии) – в диапазоне от 300 до 1100 нм. Бактериохлорофилл b поглощает свет с длиной волны 1020-1040 вплоть до 1100 нм.

У всех фотосинтезирующих прокариот дополнительные светособирающие пигменты – каротиноиды, поглощающие свет в синей и сине-зеленой части спектра (450-550 нм).

Фототрофные бактерии обитают в анаэробной зоне водоемов, где есть H 2 S. На глубину 10-30 м инфракрасное излучение не проникает, максимум энергии приходится на свет λ волн 450-500 нм.

Видимый свет влияет на поведение фототрофных бактерий. Наблюдается явление фототаксиса . Ф. – это реакция бактерий на изменение спектрального состава света или освещенности. У эубактерий фоторецепторами служат бактериохлорофиллы и каротиноиды. У архей обнаружены специальные сенсорные пигменты (у галобактерий сенсорные родопсины). Положительный фототаксис – движение бактерий к свету, отрицательный – движение клеток в сторону уменьшения освещенности.

Для некоторых бактерий, не использующих энергию света, он служит в качестве регулятора определенных процессов обмена. Так, у водной бактерии P. putida наблюдали активацию светом некоторых ферментов, что можно рассматривать как адаптацию, поскольку именно при освещении начинается синтез фитопланктона, продукты, которого используются этой гетеротрофной бактерией.

Для некоторых нефотосинтезирующих бактерий характерна фотохромность. Фотохромность – это зависимость образования пигментов от освещения. Характерна для миксобактерий, многих актиномицетов и близких им микроорганизмам. Например, синтез каротиноидов некоторыми микобактериями стимулируется синим цветом. Фотохромность может контролироваться как хромосомными, так и плазмидными генами. Пигменты способны защищать эти микроорганизмы от действия видимого цвета.

Солнечный свет обладает сильным антимикробным действием. Действие видимого света ответственно менее, чем за 1 % летальный повреждений (80 % летальных повреждений связано с действием света длиной волны менее 312 нм). Видимый свет длиной волны 450 нм индуцирует замены пар оснований и мутации сдвига рамки у E. coli . Световые волны длиной 550 нм, и особенно 410 нм вызывают фотолизис Myxococcus xanthus . Эффект определяется поглощением света железопорфиринами.

Существуют вещества фотосенсибилизаторы, в молекуле которых имеется хромофор, поглощающий свет и передающий его энергию другим молекулам, не способным поглощать свет. Через бесцветные клетки свет проходит без последствий. Но если ввести в такую клетку фотосенсибилизатор, она повреждается. Природные фотосенсибилизаторы – хлорофилл, фикобилины, порфирины и др.

Влияние инфракрасного излучения на микроорганизмы

Для излучения с длиной волны более 1100 нм к настоящему времени не зарегистрировано каких-либо биологических эффектов. Основное действие инфракрасного излучения – нагревание.

Влияние ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы

Для микроорганизмов наиболее опасно УФ-излучение. Различают ближний, средний и дальний УФ.

Ближний УФ – это излучение с длиной волны 400-320 нм .

Средний УФ – λ=320-290 нм .

Дальний УФ – λ=290-200 нм .

Ближний УФ в небольших дозах нарушает механизмы движения и таксиса. При этом хромофором является флавопротеин.

В сублетальных дозах вызывает замедление роста, скорость деления клеток, угнетается индукция ферментов, способность бактерий поддерживать развитие фага.

Эти эффекты определяются тем, что у бактерий в т-РНК в 8-й позиции присутствует необычное основание 4-тиоуридин (отсутствует у эукариот). Это основание интенсивно поглощает УФ, наибольший эффект оказывает свет с длиной волны 340 нм. Возбужденный светом 4-тиоуридин связывается с цитозином, находящемся в 13-м положении в т-РНК, что препятствует связыванию т-РНК с аминокислотами, и, следовательно, ведет к приостановке синтеза белка.

При относительно высоких дозах ближнего УФ – мутагенный и летальный эффекты. Нарушения ДНК при этом не столько сами УФ-лучи, сколько другие возбужденные светом молекулы. Также в этих эффектах имеет значение поглощение ближнего УФ 4-тиоуридином. Мутагенное и летальное действие зависит от присутствия кислорода.

Летальный эффект связан не только с повреждениями ДНК, но и мембран (их транспортных систем).

Биологические эффекты среднего и дальнего УФ сходны. ДНК интенсивно поглощает УФ в области 240-300 нм., т.е. в области среднего и дальнего УФ с пиком поглощения в области 254 нм В лаб. УФ-лампах преобладает излучение в области 260 нм (нижний предел длины волны света, падающего на земную поверхность, около 290 нм).

Средний и дальний УФ вызывает мутагенный и летальный эффекты. Основной механизм повреждающего действия – образования пиримидиновых димеров . В состав димеров могут входить два соседних тиминовых (Т-Т) или цитозиновых (С-С) или тиминовый и цитозиновый (Т-С). Образование димеров происходит за счет ковалентных взаимодействий между основаниями ДНК. Кроме этого, происходит разрыв водородных связей в ДНК. Это (и 1, и 2) ведет к появлению нежизнеспособных мутантов. Также под действием УФ происходит гидроксилирование цитозина и урацила, образование сшивок ДНК с белком, формирование поперечных сшивок ДНК, денатурация ДНК.

В связи с повреждающим и летальным действием УФ-лучи, несмотря на то, что это наиболее богатые энергией лучи, в процессе фотосинтеза не используются. Нижний предел фотосинтеза – это использование волн с длиной 450 нм.

Влияние ионизирующего излучения на микроорганизмы

Ионизирующее излучение – это излучение с очень высокой энергией, способно выбивать электроны из атомов и присоединять их к другим атомам с образованием положительных и отрицательных ионов. Полагают, что ионизация – основная причина радиационного повреждения цитоплазмы, и степень повреждения пропорциональна числу пар ионов.

Свет и большая часть солнечного излучения не обладают такой способностью.

Источником ионизирующего излучения служат радиоактивные вещества, содержащиеся в горных породах. Также поступает из космоса. В период солнечных вспышек повышается радиационный фон.

Искусственное ионизирующее излучение возникает в результате испытаний ядерного оружия, работы АЭС, применения радиоизотопов в медицине, науке и т.д.

Важное экологическое значение имеют следующие виды ионизирующего излучения :

1. α-излучение – корпускулярное излучение – это ядра атомов гелия. Длина пробега в воздухе несколько см. Их останавливает лист бумаги или роговой слой кожи человека. Однако, будучи остановленными вызывают сильную локальную ионизацию.

2. β-излучение - корпускулярное излучение – это быстрые электроны. Длина пробега в воздухе несколько метров, а в ткани несколько см.

α-излучение и β-излучение обладают наибольшим эффектом, будучи поглощены живой тканью.

3. γ-излучение – ионизирующее электромагнитное излучение. Обладает высокой проникающей способностью. Легко проникает в живые ткани. Может оказывать действие, когда источник излучения находится вне организма.

4. Рентгеновское излучение - электромагнитное излучение, очень близко к γ-излучению.

К ионизирующему излучению наиболее устойчивы микроорганизмы (более 10 6 Рад). 1 Рад – это такая доза излучения, при которой на 1 г ткани приходится 100 эрг энергии. 1 Рентген=1 Рад. Млекопитающие чувствительны к дозе 100 Рад.

Механизм повреждающего действия

Основная мишень для ионизирующего излучения – ДНК. Повреждения ДНК бывают прямыми и опосредованными. Прямые – это одноцепочечные или двухцепочечные разрывы ДНК. Бывают редко.

Более часты опосредованные повреждения. Возникают в связи с образованием свободных радикалов, которые вызывают одно- и двухцепочечные разрывы (модифицируют пиримидиновые основания), что ведет к денатурации ДНК. Кроме того, возникающие свободные радикалы вызывают денатурацию белка. Все это приводит к гибели микроорганизмов, в т.ч. вирусов.

Механизмы радиоустойчивости

1. Основным механизмом радиорезистентности (как к УФ, так и ионизирующему облучению) является хорошо отлаженная система репарации ДНК.

2. Пигменты (каротиноиды) обладают радиопротекторными свойствами, но обеспечивают эффективную защиту от действия УФ.

3. Наличие в клетках веществ-радиопротекторов (например, серусодержащие аминокислоты у D. radiophilus ), защищает клетку от излучения, но этот механизм недостаточен.

4. Клеточная стенка может играть роль в системах репарации ДНК. У D. radiophilus под действием радиации высвобождается фермент экзонуклеаза, участвующий в репарации ДНК.

5. Увеличенное содержание ДНК.

Радиорезистентность микроорганизмов варьирует в широких пределах. Степень устойчивости организма к излучениям различных типов, особенно УФ и ионизирующим излучениям могут не совпадать.

Одним из наиболее резистентных к УФ-излучению считается морской жгутиконосец Bodo marina . Устойчивость может быть связана с особенностями места обитания. Так, микроорганизмы, выделенные из родоновых источников, оказываются в 3-10 раз более резистентными к радиации, чем их сородичи из обычных мест обитания.

В охладительных системах ядерных реакторах, где доза излучения превышает 10 6 ФЭР (физический эквивалент рентгена) обитают разные бактерии, в т.ч. рода Рseudomonas .

Одна из наиболее устойчивых бактерий как к УФ, так и γ-излучению относится к дейнококкам (р. Deinococcus ) – D. radiophilus . Эта бактерия, видимо, способна репарировать даже двухнитевые разрывы ДНК, летальные для большинства микроорганизмов.