Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями. Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия или бульоном, маленькую каплю размазывают тонким слоем на предметном стекле по площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком. Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии, или этиловым либо метиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.

Большинство красителей, используемых в микробиологии, является солями двух типов. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), является кислотой и при окрашивании более интенсивно связывается с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки, например эозин. У основных красителей роль хромофора играет катион. Будучи основанием, он более интенсивно связывается с ядерными (кислыми) компонентами клетки, например метиленовый синий. Некоторые красители не образуют химических соединений, а просто растворяются или осаждаются на окружающем материале. В механизме окрашивания имеют значение как химические, так и физические процессы.

Для окрашивания бактерий чаще используют основные красители: метиловый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин, тионин. Широко используют щелочной раствор метиленового синего — краситель Леффлера, позволяющий выявить многие детали формы и структуры микробов.

Однако для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование для окрашивания только одного красителя (простой способ окраски) бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания, удовлетворяющие различным требованиям.

Способ окраски по Граму позволяет дифференцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным видам и родам. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течение 1—2 мин, а затем раствором Люголя 1—2 мин. Все микроорганизмы, находящиеся в мазке, приобретают темно-фиолетовый цвет.

После этого мазок обрабатывают 96 % этиловым спиртом в течение 30 с— 1 мин, смывая остатки спирта водой. Под влиянием спирта одни бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолетовую окраску, приданную Им комплексом красителя с йодом. Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а обесцвечивающиеся — грамотрицательными. После дополнительной окраски фуксином последние окрашиваются в красный цвет. Необходимо помнить, что на результаты окраски по Граму часто влияют небольшие отклонения в условиях культивирования или в методике окраски. Старые культуры или отмирающие клетки грамположительных бактерий могут стать грамотрицательными. В кислой среде, как правило, все микробы грамотрицательны. По отношению к окраске по способу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены и др.) и грамотрицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии и др.).

В механизме окраски по Граму имеют значение особенности химического состава микроорганизмов, различия в проницаемости клеточных стенок, наличие рибонуклеата магния у грамположительных бактерий. Между большинством грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют различия в чувствительности к сульфаниламидам, пенициллину и лизоциму.

Способ окраски по Цилю — Нильсену предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов — микобактерий туберкулеза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30—40%) содержанием особых жироподобных веществ (воски). Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или троекратном подогревании до появления паров. Видимо, благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течение 3—5 с; поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет. Остальные микробы обесцвечиваются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими. Для окраски спор, которые при обычных методах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через нее краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков. Споры можно окрасить по методу Циля—Нильсена (споры красные, вегетативное тело синее) или по Ожешко. Для этого на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени. Дальнейшую окраску производят по методу Циля — Нильсена.

Капсулы при обычных методах окраски остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсул микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Например, при окраске метиленовым синим ткани и клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, а вокруг бактерий сохраняется бесцветная зона — капсула. Из специальных методов окраски применяют способ Бурри: на край стекла наносят каплю туши и каплю исследуемого материала, перемешивают их, делают мазок (так же как мазок крови), высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, тела микробов и их капсулы тушью не окрашиваются и остаются бесцветными — негативный способ окраски.

Негативный метод Г и не а сочетает окраску тушью и фуксином. Мазок окрашивают по способу Бурри, затем высушивают, фиксируют спиртом и докрашивают фуксином Циля. Фон препарата черный, капсула не окрашена, бактериальная клетка красная.

Зерна волютина, находящиеся в клетках возбудителей дифтерии, выявляют, применяя окраску по Нейссеру. Этот сложный метод окраски включает несколько этапов: окраску фиксированного на пламени горелки препарата уксуснокислым синим (1—2 мин), затем добавление на мазок нескольких капель раствора Люголя на 1 мин и промывание водой. Препарат докрашивают раствором хризоидина или везувина в течение 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, микробные клетки —в светло-коричневый. Методы окраски жгутиков — осаждение на них танина, который действует как протрава, т. е. способствует фиксации красителя на окрашиваемом объекте (метод Лейфсона).

Для окраски простейших, а также спирохет и риккетсий широко применяют способ Романовского — Гимзы. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением ее растворяют дистиллированной или водопроводной водой (рН 7,0—7,2) из расчета 1: 10. Препарат фиксируют этиловым или хметиловым спиртом в течение 5—15 мин, окрашивают 30—40 мин, высушивают и микроскопируют. Ядро простейших, жгутики и блефа- ропласт окрашиваются в ярко-красный цвет, цитоплазма— в голубой, спирохеты и риккетсии — в сиреневато - синий или розовый.

Присутствие ДНК в клетках микроорганизмов можно определить с помощью реакции Фельгена и ее модификаций. Данный метод основан на способности ядерного материала окрашиваться в темно-пурпурный цвет при обработке реактивом Шиффа, (фуксин, обесцвеченный сернистой кислотой). Предварительно фиксированный мазок обрабатывают горячим (60°С) 1 н. раствором хлористоводородной кислоты в течение 7— 8 мин для разрушения (гидролиз) РНК, наличие которой, особенно в бактериях, затрудняет выявление ДНК. Можно также разрушить РНК специальным ферментом рибонуклеазой, а для окраски использовать красители, предложенные Романовским (азур I—II и эозин).

При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спирто-водного или водного раствора краски на 1-2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин (1:10) или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно фуксином (1:10) красят 10-30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 минут. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно, а при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще, продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

Окраска по Муромцеву

Готовят два раствора:

После растворения краски оба раствора смешивают и профильтровывают через бумажный фильтр. Краска сохраняется долгое время. Мазки красят через полоски фильтровальной бумаги в течение 15 – 30 секунд.

При данной окраске мазков в микробных клетках выявляются включения, биполярность, капсулы и споры. Метод удобен для окраски мазков из органов, крови, культур на средах с нативным белком и на полужидком агаре.

Фон препарата из указанных субстратов розовый; клетки ткани и микробные тела окрашиваются в голубовато-синие цвета.

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной (основной) краской, а другое – дополнительной (контрастной). После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивыx.

Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

Окраска по Граму

При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окра­шиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцве­чивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафра­нином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отра­зиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы оста­лся необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам кон­трольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно нали­вать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом сте­кающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По дан­ным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнитель­ная окраска фуксином Пфейффера.

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

• 1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
• 2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
• 3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
• 4. Промывают препарат водой.
• 5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

• 1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
• 2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
• 3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

• 1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
• 2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
• 3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).

Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.

2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).